【摘要】：第一部分乙型肝炎病毒X蛋白能過MEK/ERK和PI-3K/Akt信號通路上調(diào)cyclinD1并促進(jìn)肝臟卵圓細(xì)胞增殖 第一節(jié)HBX在體外對肝臟卵圓細(xì)胞增殖的直接促進(jìn)作用 目的：研究乙型肝炎病毒編碼X蛋白在體外對肝臟卵圓細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用. 方法：運用熒光顯微鏡觀察及Western blot對穩(wěn)定表達(dá)HBX的大鼠肝臟卵圓細(xì)胞系HBX-EGFP-LE/6進(jìn)行鑒定。以轉(zhuǎn)染HBX細(xì)胞系HBX-EGFP-LE/6為實驗組,轉(zhuǎn)染標(biāo)記綠色熒光蛋白空載體EGFP-LE/6、LE/6細(xì)胞系為對照組,通過MTT細(xì)胞增殖活力實驗及EDU摻入實驗比較三組細(xì)胞DNA合成速度。 結(jié)果：HBX在部分細(xì)胞克隆穩(wěn)定高表達(dá),對照組細(xì)胞未檢測到HBX表達(dá)。HBX對肝臟卵圓細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用,在同步化后培養(yǎng)24h、48h、72h,與對照組相比,HBX-EGFP-LE/6卵圓細(xì)胞系增殖加快,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。在血清刺激后,與對照組相比,HBX-EGFP-LE/6卵圓細(xì)胞系DNA合成加快,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。 結(jié)論：細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并表達(dá)的HBX蛋白對體外培養(yǎng)的肝臟卵圓細(xì)胞的增殖具有直接促進(jìn)作用,并且促進(jìn)其S期DNA合成。 第二節(jié)HBX對卵圓細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的調(diào)控作用 目的：研究HBX對肝臟卵圓細(xì)胞中細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)水平的影響,探討HBX促進(jìn)肝臟卵圓細(xì)胞增殖的分子基礎(chǔ)。 方法：穩(wěn)定表達(dá)HBX基因的肝臟卵圓細(xì)胞克隆為實驗組,表達(dá)綠色熒光蛋白的空載體組和LE/6卵圓細(xì)胞為對照組。Western blot檢測細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclinD1、CDK2、CDK4、p21、p27的表達(dá)水平 結(jié)果：與對照組相比,cyclinD1的蛋白表達(dá)水平在HBX-EGFP-LE/6細(xì)胞中顯著上調(diào),p27蛋白的表達(dá)輕微下調(diào)。 結(jié)論：HBX在肝臟卵圓細(xì)胞中影響細(xì)胞周期相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平,可能是其促進(jìn)肝臟卵圓細(xì)胞增殖的分子基礎(chǔ)之一。 第三節(jié)HBX對肝卵圓細(xì)胞MAPK信號及AKT信號的影響 目的：研究HBX在卵圓細(xì)胞LE/6中對MAPK通路信號的影響,探討HBX促進(jìn)LE/6卵圓細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。 方法：穩(wěn)定表達(dá)HBX基因的HBX-EGFP-LE/6肝臟卵圓細(xì)胞為實驗組,表達(dá)綠色熒光蛋白的空載體組和LE/6卵圓細(xì)胞為對照組；Western blot檢測了ERK、AKT、JNK、p38、p-ERK、pAKT、p-JNK、p-p38在對照組與實驗組卵圓細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。 結(jié)果：與對照組比較,在HBX-EGFP-LE/6中,p-ERk、p-Akt的表達(dá)水平升高。但ERK、Akt、JNK、p38、p-p38、p-JNK在三種細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。 結(jié)論：胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的HBX蛋白可以在體外培養(yǎng)的肝臟卵圓細(xì)胞中上調(diào)ERK、AKT信號。 第四節(jié)HBX上調(diào)cyclinD1表達(dá)并促進(jìn)肝臟卵圓細(xì)胞增殖依賴于HBX上調(diào)的ERK及AKT信號 目的：研究HBX促進(jìn)卵圓細(xì)胞增殖及上調(diào)cyclinD1是否依賴于HBX-EGFP-LE/6內(nèi)上調(diào)的ERK和／或AKT信號 方法：穩(wěn)定表達(dá)HBX基因的HBX-EGFP-LE/6肝臟卵圓細(xì)胞為實驗組,表達(dá)綠色熒光蛋白的空載體組和LE/6卵圓細(xì)胞為對照組；運用特異性信號通路抑制劑LY294002,PD184352阻斷卵圓細(xì)胞MEK/ERK及PI-3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo),然后在指定時間點westernblot檢測cyclinD1在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況；MTT檢測阻斷干預(yù)72h后各組細(xì)胞的增殖活性。 結(jié)果：抑制劑PD184352阻斷通路72h后,干預(yù)組HBX-EGFP-LE/6細(xì)胞較未干預(yù)組細(xì)胞增殖活性降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。抑制劑PD184352阻斷通路72h后,干預(yù)組HBX-EGFP-LE/6細(xì)胞較未干預(yù)組細(xì)胞增殖活性降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01). HBX-EGFP-LE/6細(xì)胞中的CyclinD1蛋白高表達(dá)水平在兩種抑制劑分別作用后均不能維持。 結(jié)論：HBX上調(diào)的卵圓細(xì)胞增殖活性和CyclinD1表達(dá)水平,依賴于HBX上調(diào)的ERK及AKT信號。 第二部分乙型肝炎病毒X蛋白通過影響TGFβ/smad通路影響肝臟卵圓細(xì)胞增殖 第一節(jié)HBX降低肝臟卵圓細(xì)胞對TGFβ1增殖抑制效應(yīng)敏感性 目的：研究卵圓細(xì)胞中HBX蛋白對TGFβ1增殖抑制效應(yīng)的影響。方法：HBX-EGFP-LE/6卵圓細(xì)胞作為實驗組, LE/6和EGFP-LE/6卵圓細(xì)胞作為對照組。運用Real-time和estern blot檢測三組卵圓細(xì)胞中TGFβ受體2mRNA及蛋白表達(dá)水平。MTT試驗比較外源性TGFβ1在三組卵圓細(xì)胞中的增殖抑制效應(yīng)。結(jié)果：TGFβ受體2在HBX-EGFP-LE/6中的mRNA及蛋白表達(dá)水平均下調(diào)。MTT表明外源性TGFβ1在對照組細(xì)胞中具有更強(qiáng)的增殖抑制效應(yīng),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。結(jié)論：HBX影響卵圓細(xì)胞對TGFβ1增殖抑制效應(yīng)的敏感度,可能與TGFβ受體2的基因表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)。 第二節(jié)乙型肝炎病毒X蛋白對卵圓細(xì)胞中smad2、smad3、smad4基因表達(dá)的調(diào)控作用 目的：研究乙型肝炎病毒編碼X蛋白HBX對肝臟卵圓細(xì)胞中TGFβ/smad中核心元件samd2、samd3、samd4表達(dá)的調(diào)控作用。 方法：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBX基因的大鼠卵圓細(xì)胞株HBX-EGFP-LE/6作為實驗組,轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白標(biāo)記空載體的大鼠卵圓細(xì)胞株EGFP-LE/6,大鼠卵圓細(xì)胞株LE/6作為對照組檢測TGF(3/smad信號通路中的核心元件smad2、smad3、samd4的表達(dá)情況。Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HBX-EGFP-LE/6,以及對照組EGFP-LE/6, LE/6中smad2、smad3、smad4的mRNA表達(dá)水平,western blot檢測三組細(xì)胞中smad2、smad3、smad4蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：與對照組相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBX基因的大鼠卵圓細(xì)胞株HBX-EGFP-LE/6中smad2的mRNA及蛋白表達(dá)水平未有顯著變化。smad3、smad4的mRNA表達(dá)水平有顯著降低(p0.05), Smad3蛋白表達(dá)水平有一定程度降低,smad4蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化。 結(jié)論：乙型肝炎病毒編碼X蛋白可以在卵圓細(xì)胞中影響TGFβ/smad信號通路中的核心元件smad3的轉(zhuǎn)錄及蛋白合成,對samd4的轉(zhuǎn)錄有一定影響,對smad2的表達(dá)沒有顯著作用。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R512.62

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2726790