【摘要】：治療終末期肝病所致的肝功能衰竭是臨床治療的一大難題,目前除了改善臨床癥狀外沒有較為有效的治療手段,尤其是無法再生損傷、死亡的肝臟細(xì)胞,這使得肝移植可能成為目前一種可恢復(fù)肝臟功能的治療方法,然而因其供體短缺、免疫排斥、治療費用較高等原因,臨床應(yīng)用難以推廣�，F(xiàn)在隨著細(xì)胞生物技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,以及對干細(xì)胞研究的深入,通過干細(xì)胞移植治療慢性肝病越來越受到國內(nèi)外專家的重視。干細(xì)胞是一類具有無限自我增殖更新能力的多潛能細(xì)胞,在特定的條件下具有定向誘導(dǎo)分化的潛能,如在特定的條件下,干細(xì)胞能夠向內(nèi)胚層的肝臟細(xì)胞分化。因此,干細(xì)胞再生技術(shù)為肝病的治療提供了一種新的研究方向。 目的:本課題組已在前期研究工作中證明大鼠周圍血干細(xì)胞在一定條件下可以誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞。此次本實驗研究經(jīng)rhG-CSF動員后肝硬化患者外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)中CD34+細(xì)胞的含量,以及PBMCs在HGF、FGF-4誘導(dǎo)因子的作用下能否向肝臟樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,證實外周血干細(xì)胞的可塑性,進一步為臨床上探索外周血干細(xì)胞移植治療肝病提供理論依據(jù)。 方法: 1.用血細(xì)胞分離機采集經(jīng)G-CSF動員后肝硬化患者的外周血單個核細(xì)胞,并通過流式細(xì)胞儀檢測CD34的含量。 2.密度梯度離心法分離純化單個核細(xì)胞。用RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)外周血單個核細(xì)胞,并洗滌未貼壁細(xì)胞,進一步出去雜細(xì)胞,使之純化。 3.用含10%胎牛血清、M-CSF、IL-3、β-巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)貼壁細(xì)胞6天,每2天換液1次。 4. 6天后半量換液,加入含有10%胎牛血清、HGF、FGF-4的RPMI1640培養(yǎng)液對貼壁細(xì)胞誘導(dǎo),每2天半量換液1次并繼續(xù)培養(yǎng)到第20天。 5.在培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化,免疫熒光法檢測第6、14、20天肝細(xì)胞標(biāo)志物AFP、CK18的表達情況。 6.對于誘導(dǎo)后7天、14天細(xì)胞Western Blot檢測肝細(xì)胞特異性表達。 結(jié)果: 1.血細(xì)胞分離機分離出的外周血中單個核細(xì)胞數(shù)≥109/kg,CD34+含量為0.4%。 2.分離出的細(xì)胞呈圓形,臺盼蘭染色檢測細(xì)胞活率95%,培養(yǎng)2小時后,培養(yǎng)液洗滌去除未貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞呈現(xiàn)小圓形,大小均勻,透明度大。 3.在M-CSF、IL-3培養(yǎng)基中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞6天后,可觀察到細(xì)胞呈圓形,集落成群生長,細(xì)胞趨向融合。在未給予增殖因子的對照組中,細(xì)胞大部分呈現(xiàn)梭形伸展,單個生長。 4.經(jīng)HGF、FGF-4誘導(dǎo)7天后,可見細(xì)胞一部分呈現(xiàn)多邊形,體積變大;誘導(dǎo)14天后,細(xì)胞總體數(shù)量減少,多邊形細(xì)胞比例增多。未加誘導(dǎo)因子的對照組,細(xì)胞呈梭形生長,大部分細(xì)胞貼壁伸展。 5.對誘導(dǎo)后第14、20天的細(xì)胞用免疫熒光法檢測AFP、CK18的表達,熒光顯微鏡下顯示結(jié)果均為陽性。對照組以及加入誘導(dǎo)因子前AFP和CK18的表達為陰性。 6.誘導(dǎo)7天、14天的細(xì)胞經(jīng)Western Blot檢測到肝細(xì)胞特異性表達。 結(jié)論:外周血單個核細(xì)胞在一定的條件下具有向肝臟樣細(xì)胞分化的潛能,并可能代替骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝病。 1.動員后肝硬化患者外周血單個核細(xì)胞,體外在一定誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下可轉(zhuǎn)分化為肝樣細(xì)胞。 2.轉(zhuǎn)分化的肝樣細(xì)胞可有AFP、ALB、CK-18的表達,其中,ALB、CK-18表達強度與培養(yǎng)時間成正比,而AFP成反比。 3.未進行誘導(dǎo)培養(yǎng)的單個核細(xì)胞很少轉(zhuǎn)分化為肝樣細(xì)胞。 4.外周血單個核細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為有肝細(xì)胞功能的同時,有細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,近似于肝細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R575.3
【圖文】：

（二）B 組未加任何增殖誘導(dǎo)因子培養(yǎng)：新鮮分離的外周血單個核細(xì)胞為透形，大小均一，折光性較強，臺盼蘭染色測定活細(xì)胞率>95%，培養(yǎng) 4-6 小時上清，棄去未貼壁細(xì)胞后可見貼壁細(xì)胞，呈圓形、類圓形。培養(yǎng) 7 天后細(xì)胞個生長未見集落，部分細(xì)胞逐漸伸展呈梭形生長。14 天后細(xì)胞大部分呈纖維樣部分仍類圓形。見圖 3。圖 3：新鮮分離的 PBMCs 圖 3：培養(yǎng)第 7 天的 PBMCs倒置相差顯微鏡（x10） 倒置相差顯微鏡（x10）

圖 2：L02 肝臟細(xì)胞倒置相差顯微鏡（x20）（二）B 組未加任何增殖誘導(dǎo)因子培養(yǎng)：新鮮分離的外周血單個核細(xì)胞為透形，大小均一，折光性較強，臺盼蘭染色測定活細(xì)胞率>95%，培養(yǎng) 4-6 小時上清，棄去未貼壁細(xì)胞后可見貼壁細(xì)胞，呈圓形、類圓形。培養(yǎng) 7 天后細(xì)胞個生長未見集落，部分細(xì)胞逐漸伸展呈梭形生長。14 天后細(xì)胞大部分呈纖維樣部分仍類圓形。見圖 3。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2726635