【摘要】：背景：自身免疫性肝炎(AIH)發(fā)病機(jī)制尚未闡明,目前認(rèn)為是具有遺傳易感性個(gè)體在環(huán)境因素的誘發(fā)下喪失了對(duì)自身肝細(xì)胞的免疫耐受,通過(guò)激活多種針對(duì)肝臟自身抗原的免疫應(yīng)答引起了肝臟損傷。而枯否細(xì)胞(KC)作為定居在肝臟的巨噬細(xì)胞,在免疫耐受的形成和維持中具有重要作用。有研究認(rèn)為KC被腸源性毒素激活,生物學(xué)功能發(fā)生改變并釋放一系列炎性因子,可進(jìn)一步造成免疫耐受破壞。因此,明確AIH患者是否存在腸黏膜屏障損傷,細(xì)菌移位活化KC并誘導(dǎo)KC出現(xiàn)一系列生物學(xué)功能改變,導(dǎo)致免疫耐受缺失,從而啟動(dòng)免疫反應(yīng)值得進(jìn)一步探討。 目的：本研究擬評(píng)價(jià)AIH患者腸黏膜屏障功能,從Toll樣受體(TLR)激活的角度研究腸源性毒素活化KC的情況,進(jìn)一步評(píng)價(jià)活化的KC細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白、外周血單核細(xì)胞吞噬功能及抗原遞呈功能的變化情況,明確AIH患者腸黏膜屏障功能破壞及其對(duì)KC的影響以及KC生物學(xué)功能變化情況,將為揭示KC在免疫反應(yīng)中的作用提供理論依據(jù),加深其在腸道—肝臟互作中的理解,而且將為深入研究AIH的發(fā)病機(jī)制提供新的視角和思路。 方法： 第一部分取我院2012年～2013年診斷為AIH行胃鏡檢查患者十二指腸降段黏膜組織,并留取患者外周血及糞便標(biāo)本,同時(shí)設(shè)健康體檢者為對(duì)照組。檢測(cè)肝功能ALT水平；在光鏡下及電鏡下觀察十二指腸黏膜組織結(jié)構(gòu)的病理變化并應(yīng)用免疫組織化學(xué)法分析十二指腸黏膜組織中緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達(dá)水平；以細(xì)菌16SrDNA熒光定量PCR方法測(cè)定糞便中關(guān)鍵細(xì)菌的含量；采用鱟珠實(shí)驗(yàn)測(cè)定血漿內(nèi)毒素(LPS)水平。 第二部分取我院2011年～2013年診斷為AIH行肝活檢患者肝組織,同時(shí)取非酒精性脂肪性肝病行肝活檢患者肝組織設(shè)為對(duì)照組。采用Western blot檢測(cè)肝組織TLR4的表達(dá)量；采用免疫熒光雙標(biāo)的方法確定KC上TLR4的表達(dá)情況。 第三部分采用Western blot檢測(cè)肝組織Rac1通路上下游VAV1和PAK1的表達(dá)量并采用免疫熒光雙標(biāo)的方法明確其在KC上的表達(dá)情況；采用梯度離心法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),用熒光抗體偶聯(lián)的特異性抗體標(biāo)記CD80、HLA-DR單核細(xì)胞表面分子,用流式細(xì)胞儀測(cè)定這兩種抗原遞呈分子在單核細(xì)胞表面的表達(dá)情況,從而判斷單核細(xì)胞的抗原遞呈能力；單核細(xì)胞通過(guò)CD14單克隆磁珠抗體分選獲得,將單核細(xì)胞與FITC標(biāo)記的大腸桿菌共培養(yǎng),利用流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)單核細(xì)胞的吞噬能力。 結(jié)果： 第一部分(1)AIH肝功異常組、AIH肝硬化組血清ALT水平較健康對(duì)照組均明顯升高(AIH肝功異常組VS健康對(duì)照組為:263.7±57.2U/L vs22.3±5.7U/L, P=0.000; AIH肝硬化組VS健康對(duì)照組為：286.4±36.8U/L vs22.3±5.7U/L,P=0.000)；(2)病理檢查發(fā)現(xiàn)AIH患者十二指腸黏膜微絨毛受損,變短,密度減低,上皮細(xì)胞間隙增寬,胞核固縮,且損傷程度與疾病嚴(yán)重程度一致；(3)AIH肝功正常組、AIH肝功異常組及AIH肝硬化組ZO-1蛋白均存在分布不均,并且胞質(zhì)染色程度較健康對(duì)照組明顯減低,4組染色評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.775,P=0.0389)；AIH各組occludin染色散亂,染色程度明顯低于健康對(duì)照組,4組染色評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.351,P=0.0216)；(4)AIH患者存在腸道菌群失調(diào),最突出的改變?yōu)殡p歧桿菌和乳酸桿菌為代表的厭氧菌數(shù)量下降(P均0.05),大腸桿菌和腸球菌為代表的需氧菌數(shù)量變化不大；雙歧桿菌／大腸桿菌(Bifidobacteria/escherichia coli, B/E)值下降(P均0.05),且三組間兩兩比較均有差異(P均0.05)；(5)AIH肝功正常組、AIH肝功異常組、AIH肝硬化組血漿LPS水平較健康對(duì)照組均升高(AIH肝功正常組VS健康對(duì)照組為：7.47±1.64pg/ml vs5.26±0.86pg/ml, P=0.026; AIH肝功異常組VS健康對(duì)照組為：9.75±1.53pg/ml vs5.26±0.86pg/ml,P=0.012; AIH肝硬化組VS健康對(duì)照組為：14.23±4.23pg/ml vs5.26±0.86pg/ml,P=0.006),AIH三組間兩兩比較均有差異(P均0.05)。 第二部分(1)AIH肝功正常組、AIH肝功異常組、AIH肝硬化組肝組織TLR4蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P均0.05),且三組間兩兩比較均有差異(P均0.05)；(2)AIH患者組定位于KC上的TLR4明顯高于對(duì)照組。 第三部分(1)AIH肝功正常組、AIH肝功異常組、AIH肝硬化組肝組織VAV1和PAK1蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P均0.05),且三組間兩兩比較均有差異(P均0.05)；(2)AIH患者組定位于KC上的VAV1和PAK1明顯高于對(duì)照組；(3)AIH肝功正常組、AIH肝功異常組、AIH肝硬化組外周血單核細(xì)胞HLA-DR+細(xì)胞所占比例較對(duì)照組明顯降低(AIH肝功正常組VS對(duì)照組為：97.06±2.73%vs99.21±0.52%,P=0.036；AIH肝功異常組VS對(duì)照組為：92.57±6.93%vs99.21±0.52%,P=0.027；AIH肝硬化組VS對(duì)照組為：89.74±10.41%vs99.21±0.52%,P=0.018),AIH三組間兩兩比較均有差異(P均0.05)；AIH肝功正常組、AIH肝功異常組、AIH肝硬化組外周血單核細(xì)胞CD80+細(xì)胞所占比例較對(duì)照組均明顯降低(AIH肝功正常組VS對(duì)照組為：79.15±10.29%vs82.34±5.38%,P=0.032；AIH肝功異常組VS對(duì)照組為：74.72±10.74%vs82.34±5.38%,P=0.019；A1H肝硬化組VS對(duì)照組為：70.84±12.47%vs82.34±5.38%,P=0.012),AIH三組間兩兩比較均有差異(P均0.05)；(4)AIH各組吞噬率較對(duì)照組均明顯降低(AIH肝功正常組VS對(duì)照組為：4.34±1.82%vs6.144±2.23%,P=0.027；AIH肝功異常組VS對(duì)照組為：3.27±2.04%vs6.14±2.23%,P=0.016；AIH肝硬化組VS對(duì)照組為：2.03±±1.47%vs6.14±2.23%,P=0.011),AIH三組間兩兩比較均存在差異(P均0.05)。 結(jié)論： (1)AIH患者腸黏膜上皮破壞、緊密連接蛋白減少、腸道菌群失調(diào)致腸黏膜屏障功能損傷,腸黏膜通透性增高致細(xì)菌移位,血漿LPS升高,且腸黏膜屏障損傷程度與肝臟發(fā)病嚴(yán)重程度相關(guān),提示腸黏膜屏障功能受損與AIH的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。 (2)AIH患者腸源性內(nèi)毒素LPS通過(guò)TLR4激活KC。 (3)AIH患者KC的Rac1通路過(guò)度激活,結(jié)合外周血單核細(xì)胞抗原提呈能力減低,吞噬能力減低,推測(cè)患者單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞骨架變化影響其功能狀態(tài)。 綜上所述,AIH患者存在腸黏膜屏障損傷,LPS可能沿腸黏膜通透性升高→細(xì)菌移位→TLR4激活→KC活化并出現(xiàn)生物學(xué)功能改變→免疫耐受缺失這條軸線誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。本研究不僅能打開LPS與KC相互作用的新視角,而且能幫助證實(shí)“腸-肝軸”理論即腸黏膜通透性升高致細(xì)菌移位,LPS誘發(fā)AIH的免疫耐受損傷機(jī)制,最終改善腸道屏障功能可能成為治療AIH的新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R575.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2725960