【摘要】：目的:以往研究表明肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)的疾病機(jī)制與肺內(nèi)病理性血管新生導(dǎo)致通氣/血流(V/Q)比例失調(diào),肺內(nèi)動靜脈分流以及氧氣擴(kuò)散障礙有關(guān)。研究者發(fā)現(xiàn)脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)參與內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖以及血管發(fā)生。本研究旨在探討Syk在HPS大鼠肺中的表達(dá)變化及其與HPS病理性血管新生的關(guān)系,并探究Syk調(diào)控HPS病理性血管新生的相關(guān)機(jī)制。方法:1.分組及CBDL大鼠模型構(gòu)建采用大鼠CBDL(Common bile duct ligation,CBDL)模型模擬人HPS病理發(fā)生,假手術(shù)(Sham)組大鼠為正常大鼠,然后取肺組織用于病理切片觀察和后續(xù)試驗,取動脈血用于檢測動脈血氣。(1)未干預(yù)實驗大鼠分組:成年健康SD大鼠40只,隨機(jī)分成四組(n=10)即:Sham組,膽總管結(jié)扎術(shù)后一周(CBDL1W,1W)組,膽總管結(jié)扎術(shù)后三周(CBDL3W,3W)組,膽總管結(jié)扎術(shù)后五周(CBDL5W,5W)組。CBDL1W組大鼠在建模后1W取材,CBDL3W組在建模后3W取材,Sham組和CBDL5W組大鼠在建模后5W取材。(2)干預(yù)實驗大鼠分組:成年健康SD大鼠30只,隨機(jī)分成三組(n=10)即:Sham組,CBDL5W組,R788干預(yù)(R788)組。R788組大鼠在建成CBDL大鼠模型后每天腹腔注射R788(20mg/Kg)并飼養(yǎng)至第五周取材;Sham組和CBDL5W組大鼠在建模后每天注射等量生理鹽水并飼養(yǎng)至第五周取材。2.檢測Syk及下游p-Erk1/2和p-Akt在CBDL大鼠肺中表達(dá)的水平qPCR和Western blot法分別檢測Syk、Erk1/2(Mapk3/Mapk1)及Akt在各組大鼠肺中mRNA的表達(dá),以及Syk、p-Erk1/2和p-Akt在CBDL大鼠肺中蛋白水平的表達(dá)。3.檢測Syk及下游p-Erk1/2和p-Akt在CBDL大鼠肺中的表達(dá)和定位利用免疫組化和免疫熒光可觀察目的蛋白表達(dá)分布的特點,從而對Syk的表達(dá)進(jìn)行定位。結(jié)果:1.CBDL大鼠肺大體外觀、血氣分析及病理學(xué)改變Sham大鼠肺正常,而CBDL鼠肺外觀可見淤血點和壞死病灶。動脈血氣顯示與Sham大鼠比較,CBDL大鼠PaO_2降低和A-aDO_2升高(P0.05)。HE染色觀察可見CBDL大鼠肺結(jié)構(gòu)混亂,伴炎性細(xì)胞浸潤,肺泡間隔增厚,并且CBDL大鼠肺微血管直徑較Sham組有增寬(P0.05)。2.Syk在CBDL大鼠肺中的表達(dá)改變(1)與Sham相比,Syk、Erk1/2(Mapk3/Mapk1)及Akt mRNA水平在CBDL大鼠肺中的表達(dá)顯著升高,升高趨勢呈時間依賴性(P0.05);(2)與Sham相比,CBDL大鼠肺Syk、p-Erk1/2及p-Akt蛋白表達(dá)明顯升高,其趨勢在3W組和5W組更顯著(P0.05)。3.Syk在CBDL大鼠肺中的表達(dá)和定位(1)免疫組化結(jié)果觀察到Syk表達(dá)在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞,且Syk、p-Erk1/2及p-Akt在CBDL大鼠的表達(dá)量顯著高于Sham組(P0.05);(2)用CD34陽性率代表平均微血管密度(Mean microvessel density,MVD)發(fā)現(xiàn),CBDL大鼠的平均血管密度顯著高于Sham組(P0.05);(3)免疫熒光觀察到Syk定位于肺內(nèi)微血管,CBDL組肺內(nèi)微血管數(shù)目多于Sham組(P0.05)。4.Syk抑制劑R788抑制Syk表達(dá),下調(diào)p-Erk1/2和p-Akt并減少新生血管(1)與CBDL 5W相比,R788組大鼠肺外觀及病理改變得到改善,肺微血管直徑減小(P0.05),PaO_2升高和A-aDO_2下降(P0.05);(2)與CBDL 5W相比,R788組Syk、p-Erk1/2及p-Akt蛋白活性表達(dá)下降(P0.05),并且平均微血管密度(MVD)也顯著下降(P0.05);(3)熒光鏡觀察到R788組新生血管數(shù)目少于CBDL 5W組(P0.05)。結(jié)論:1.以上研究結(jié)果顯示,在HPS病理性血管新生的進(jìn)程中,Syk表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)和激活了p-Erk1/2和p-Akt的活性表達(dá),導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移并形成新生血管;2.Syk抑制劑R788抑制了Syk在肺微血管的表達(dá),同時也下調(diào)了p-Erk1/2和p-Akt的表達(dá),從而從分子機(jī)制上抑制了肺內(nèi)血管新生并改善HPS氧合。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575;R563
【圖文】：

2.1.1 術(shù)后行為觀察Sham 組大鼠進(jìn)食較多，較活潑，體重隨喂養(yǎng)時間增加。CBDL 大鼠飲食較差，活動減少，鼠毛較亂光澤差，瘦弱，耳朵呈弱黃色。2.1.2 腹主動脈血氣分析相較于 Sham 組，3W 組及 5W 組 PaO2有所下調(diào)，A-aDO2則上升（P<0.05）(見表 3，圖 1)。表 3 CBDL 組大鼠與 Sham 組血氣分析的結(jié)果比較(n=150, x ±s)Sham 組 1W 組 3W 組 5W 組PaO2（mmHg） 96.32±2.31 88.65±2.86 78.69±1.62*75.62±1.15*A-aDO2(mmHg） 8.10±1.43 13.21±1.38 20.01±0.89*22.67±0.71*注：相比于 Sham 組，*P < 0.05

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 艾祥發(fā)2.1.3 大鼠肺大體外觀及病理學(xué)觀察（1）Sham 大鼠肺外觀和 CBDL 鼠肺外觀的比較大鼠肺外觀可見 Sham 大鼠肺紅潤，無出血點和壞死病灶；而 CBDL 大鼠肺觀察到淤血點和壞死病灶。1W 組在下肺段可見點狀病變，病灶相對少，病變輕微；3W組可見雙側(cè)肺組織彌漫性散在點狀病變，病變較重；5W 組則雙肺多處點狀及融合壞死病灶，病變極為嚴(yán)重（見圖 2）。

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本文編號：2725072