【摘要】：目的:研究通過嘌呤能離子通道型7受體(purinergic receptor P2X,ligand-gated ion channel 7,P2X7R)通路改善肝星狀細(xì)胞活化導(dǎo)致的肝纖維化的作用及重要性;探究P2X7R、Toll樣受體-4(toll like receptor-4,TLR4)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)式受體 3(NLR family,pyrin domain containing 3,NLRP3)三者軸線的在肝纖維化中的作用,為肝纖維化治療靶點(diǎn)提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:體外實(shí)驗(yàn)選用人肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)系LX-2細(xì)胞,在給與P2X7R選擇性抑制劑A438079、TLR4抑制劑CLI-095、caspase-1特異性抑制劑Ac-YVAD-cmk預(yù)處理一個(gè)小時(shí)后,用轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)刺激24 h,提取相應(yīng)細(xì)胞總蛋白和RNA,通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)、PCR技術(shù)以及免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)來測定人肝星狀細(xì)胞LX-2細(xì)胞活化過程中纖維化指標(biāo)α-平滑肌細(xì)胞肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)以及Ⅰ型膠原蛋白(collagen type Ⅰ,collagen Ⅰ)的表達(dá);為進(jìn)一步證明P2X7R在肝纖維化中發(fā)揮的作用,用 CMV(Cytomegalovirus,pronounced sy-toe-MEG-a-low-vy-rus)質(zhì)粒或CMV-P2X7R質(zhì)粒對LX-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,使P2X7R表達(dá)增加后給與TGF-β刺激24 h,檢測細(xì)胞中相應(yīng)肝纖維化指標(biāo)標(biāo)志蛋白collagen Ⅰ和α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)情況,并用免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證;用佛波脂(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)誘導(dǎo)分化人急性白血病單核細(xì)胞(human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)作為巨噬細(xì)胞,將脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)或脂多糖聯(lián)合腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)刺激巨噬細(xì)胞所得的上清液作為條件培養(yǎng)基間接刺激人肝星狀細(xì)胞的組別與LPS或LPS聯(lián)合ATP直接刺激人肝星狀細(xì)胞的組別進(jìn)行比較,采用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)、PCR技術(shù)和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測肝纖維化相關(guān)標(biāo)志collagen Ⅰ和α-SMA的表達(dá);PMA誘導(dǎo)分化THP-1細(xì)胞成為巨噬細(xì)胞后用P2X7R選擇性抑制劑A438079、TLR4抑制劑CLI-095、caspase-1特異性抑制劑Ac-YVAD-cmk預(yù)處理一小時(shí),再用LPS刺激4 h,收細(xì)胞前30 min給與ATP刺激,收集到的上清液通過Elisa檢測細(xì)胞外炎癥相關(guān)因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-lβ,IL-1β)的表達(dá)情況;人肝星狀細(xì)胞用上述收集的上清液作為條件培養(yǎng)基刺激24 h,通過蛋白免疫印跡、PCR技術(shù)和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測肝纖維化相關(guān)指標(biāo)collagen Ⅰ和α-SMA的表達(dá);結(jié)果:P2X7R選擇性抑制劑-A438079、TLR4抑制劑-CLI-095、caspase-1特異性抑制劑-Ac-YVAD-cmk能夠降低TGF-β激活的人肝星狀細(xì)胞中纖維化指標(biāo)α-S1MA、collagen Ⅰ的表達(dá);P2X7R過表達(dá)與TGF-β共同刺激的LX-2細(xì)胞α-SMA、collagen Ⅰ的表達(dá)增加;條件培養(yǎng)基間接刺激LX-2細(xì)胞的組別與直接用LPS或LPS聯(lián)合ATP刺激LX-2細(xì)胞的組別相比,條件培養(yǎng)基間接刺激LX-2細(xì)胞的組別肝纖維化相關(guān)指標(biāo)collagen Ⅰ、α-SMA的表達(dá)升高;經(jīng)LPS與ATP聯(lián)合作用于巨噬細(xì)胞所得的上清液中IL-1β的表達(dá)升高,A438079、CLI-095、Ac-YVAD-cmk預(yù)處理的組別表達(dá)降低;LX-2細(xì)胞經(jīng)LPS與ATP聯(lián)合刺激巨噬細(xì)胞所得的上清液處理,肝纖維化相關(guān)各項(xiàng)指標(biāo)collagen Ⅰ、α-SMA表達(dá)升高,而巨噬細(xì)胞預(yù)處理A438079、CLI-095、Ac-YVAD-cmk所得上清液刺激LX-2細(xì)胞可以有效的降低上述相關(guān)因子的表達(dá);結(jié)論:P2X7R的激活促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞的活化,P2X7R/TLR4/NLRP3軸線可調(diào)控TGF-β所激活肝星狀細(xì)胞的活化,LPS活化的巨噬細(xì)胞釋放的細(xì)胞外炎癥因子IL-1β對肝星狀細(xì)胞向纖維化發(fā)展有促進(jìn)作用,而P2X7R/TLR4/NLRP3軸線可調(diào)控肝纖維化中巨噬細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞的交叉對話。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575.2
【圖文】：

圖３－１．邋Ｐ２Ｘ７Ｒ／ＴＬＲ４／ＮＬＲＰ３通路對ＴＧＦ－Ｐ所激活的肝星狀細(xì)胞的影響。（Ａ）相應(yīng)抑制劑逡逑預(yù)處理ＬＸ－２細(xì)胞１小時(shí)，給與ＴＧＦ－Ｐ刺激２４小時(shí)，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)ａ－ＳＭＡ與ｃｏｌｌａｇｅｎ邋Ｉ逡逑的蛋白表達(dá)結(jié)果。（Ｂ）相應(yīng)抑制劑預(yù)處理ＬＸ－２細(xì)胞１小時(shí)，給與ＴＧＦ－Ｊ３刺激２４小時(shí)，逡逑蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)ａ－ＳＭＡ與ｃｏｌｌａｇｅｎ邋Ｉ的ｍＲＮＡ表達(dá)結(jié)果。＃Ｐ＜０．０５，邋＃＃＃Ｐ＜０．００１，與正常逡逑組相比；＊Ｐ＜０．０５，邋＊＊Ｐ＜０．０１，邋＊＊＊Ｐ＜０．００１，與邋ＴＧＦ－Ｐ邋刺激組相比。逡逑

２Ｃ的結(jié)果來看，當(dāng)ＴＧＦ－ｐ刺激和Ｐ２Ｘ７Ｒ激活的雙重作用下ｃｏｌｌａｇｅｎ邋Ｉ逡逑和ａ－ＳＭＡ的蛋白及ｍＲＮＡ的表達(dá)要比單一作用下的表達(dá)要明顯增多，免疫焚光逡逑染色實(shí)驗(yàn)（圖３Ａ，３Ｂ）也驗(yàn)證了以上的結(jié)果。提示Ｐ２Ｘ７Ｒ在肝纖維化方面潛在逡逑的作用，Ｐ２Ｘ７Ｒ的激活促進(jìn)了邋ＴＧＦ－Ｐ誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞的活化。逡逑１２逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

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本文編號：2725308