【摘要】：鐵是生物體內重要的微量元素，參與細胞內多種氧化還原反應，調節(jié)細胞生長分化。但是鐵在體內的大量聚積，可以誘導機體內活性氧水平的上升，引起生物大分子（蛋白質、DNA和脂質）的氧化，最終對機體造成損傷。在酒精性肝病發(fā)生的過程中，鐵有重要的作用。酒精性肝病患者的肝組織中通常存在大量鐵的聚集。雖然現在已經有動物研究表明鐵對酒精引起得肝臟損傷具有正協(xié)同的作用，但是還沒有在細胞水平研究鐵對酒精誘導肝細胞損傷的影響。黃酮類化合物是廣泛存在于植物中的多酚類物質，也是多種具有益生作用植物的有效成分。大量的動物實驗證明，很多黃酮類化合物對于慢性或急性酒精刺激誘導的肝損傷，具有一定的治療或預防效果。但是沒有構建出合適的鐵-酒精肝細胞損傷模型用于篩選治療或預防酒精性肝損傷的黃酮類化合物。 本文從細胞水平實驗入手，首先分析了不同形態(tài)的鐵的催化氧化能力與肝細胞損傷之間的關系；然后利用從中篩選的檸檬酸鐵作為外源鐵添加劑，在HepG2細胞（在該細胞系中CYP2E1不表達）中，研究了鐵的催化氧化的作用對酒精誘導氧化應激的影響，以及黃酮類化合物保護作用的機理。主要結果如下： （1）不同形態(tài)的鐵催化氧化的能力與肝細胞損傷之間的關系。 首先，在體外化學體系上研究了高鐵血紅蛋白以及三種非蛋白結合小分子鐵化合物——氯高鐵原卟啉、檸檬酸鐵和EDTA-Fe（III）——催化氧化的能力。再以人肝癌細胞系HepG2為研究對象，采用MTT法檢測細胞活性，Annexin V/PI雙染法流式檢測細胞凋亡，免疫熒光的方法檢測細胞蛋白質硝基修飾的情況和4-HNE的水平，免疫沉淀和蛋白質印跡的方法檢測α-烯醇酶的表達和硝化。結果顯示：在體外化學體系中，氯高鐵原卟啉和高鐵血紅蛋白具有較強的催化氧化的能力，檸檬酸鐵基本上沒有催化氧化的能力，EDTA-Fe（III）催化氧化的能力相對較弱；在細胞水平上，氯高鐵原卟啉和EDTA-Fe（III）可以促進葡糖糖氧化酶（GO）/葡糖糖（G）-NaNO2體系誘導細胞凋亡的程度，氯高鐵原卟啉鐵的作用要明顯高于EDTA-Fe（III），檸檬酸鐵和高鐵血紅蛋白構建的Fe（III）-GO/G-NaNO2體系不能誘導細胞凋亡；不同鐵構成的Fe（III）-GO/G-NaNO2對于細胞內蛋白質的表達和硝化、脂質過氧化的影響不同。這表明：在體外化學體系中，含鐵化合物催化氧化的作用，主要依賴卟啉鐵的參與；在細胞體系中，含鐵化合物對肝細胞內蛋白質表達或硝化、脂質過氧化、細胞凋亡的影響和它自身催化氧化的能力沒有直接的關系。 （2）檸檬酸鐵促進酒精誘導的HepG2細胞內氧化應激及黃芩苷的作用。 以HepG2細胞（在該細胞系中CYP2E1不表達）為研究對象，采用MTT法檢測細胞活性、Annexin V/PI雙染法流式細胞儀檢測細胞凋亡、免疫熒光的方法檢測細胞iNOS表達、蛋白質酪氨酸硝化和4-HNE的水平、蛋白質印跡的方法檢測細胞內蛋白質羰基化程度和ERK1/2磷酸化的程度、用DCFH和DMA-DA熒光探針檢測細胞內ROS和NO的水平，研究了鐵對酒精誘導的氧化/硝化應激的影響以及黃芩苷的作用。結果表明：鐵對酒精誘導的細胞內ROS、NO、蛋白質羰基化、蛋白質酪氨酸硝化和脂質過氧化水平的上升具有促進的作用；鐵和酒精的共同作用還可以改變iNOS在細胞的分布；鐵增加了酒精誘導肝細胞凋亡的程度；在酒精-鐵模型中，抑制iNOS的活性可以增加細胞死亡的數量；鐵和酒精可以增加ERK1/2的磷酸化水平，酒精抑制了ERK1/2磷酸化的水平；黃芩苷可以通過降低細胞內ROS、NO、蛋白質羰基化、蛋白質酪氨酸硝化和脂質過氧化的水平，阻斷鐵和酒精引起的iNOS在細胞內分布的變化，減低ERK1/2磷酸化的程度，從而減少了細胞凋亡的程度；iNOS活性的抑制可以增強鐵和酒精誘導的細胞凋亡的程度。這說明：雖然在酒精誘導肝細胞內發(fā)生氧化應激的過程中CYP2E1發(fā)揮了重要的作用，但是在CYP2E1不表達的肝細胞中外源鐵可以促進酒精誘導的氧化應激；參與調控酒精和鐵誘導氧化應激的細胞內信號通路是不一樣的；在鐵-酒精細胞模型中，NO可能是一種信號分子，具有保護細胞的作用。 （3）研究鐵-酒精肝細胞損傷模型中黃酮類化合物護肝作用的機理 采用MTT法檢測細胞活性，ABTS法檢測黃酮類化合物的抗氧化作用，并利用PI單染活細胞檢測檢測死亡細胞的數目，最后利用熒光顯微鏡檢測細胞內超氧陰離子的水平，綜合研究了在鐵-酒精肝細胞損傷模型中，黃酮類物質保護肝細胞的作用與它的抗氧化性和鐵結合能力之間的關系。結果表明：在鐵-酒精肝細胞損傷模型中黃酮類化合物的保護作用主要和它的鐵結合能力有關，但并不是具有鐵結合能力的黃酮類化合物都會在這個細胞模型中發(fā)揮保護肝細胞的作用；利用超氧陰離子探針可以在熒光顯微鏡下直接觀察到酒精、鐵、黃酮類物質對于細胞內氧化應激的影響，這克服了一些黃酮類化合物由于具有胰蛋白酶的抑制效果而造成的研究方法選擇上的障礙；本文中構建的鐵-酒精肝細胞損傷模型不僅可以用來篩選具有護肝作用的單一黃酮類化合物，也可以用來分析天然提取物在鐵-酒精誘導肝細胞損傷中的作用。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R575
【圖文】：

圖 1.1 四種黃酮類化合物的結構式Figure 1.1 The molecular structure of each group of flavonoids.生理作用1 抗氧化作用對大多數的黃酮類物質都具有抗氧化的作用。其中，黃酮類和兒茶酚類是免除自由基損傷效果最好的黃酮類物質。機體受到外源性損傷或者氧化代謝時，可以產生自由基和活性氧，這些物組織細胞造成持續(xù)的危害。雖然，目前的研究還不能對于自由基干擾細胞體機制給出全面的解釋，但是脂質過氧化以及由脂質過氧化引起的細胞膜為在其中發(fā)揮著重要的作用。細胞膜損傷改變了細胞的凈電荷和滲透壓，細胞的膨脹，最終導致細胞壞死。自由基可以引起多種炎癥調節(jié)因子的產生發(fā)炎癥反應和組織損傷。

催化氧化能力的差別。利用亞甲基藍的方法，測定不同類型的鐵催化氧化產生的羥自由基的能力（圖2.1）。含有氯高鐵原卟啉（H）和高鐵血紅蛋白（Mb）具有較強的催化氧化的能力，檸檬酸鐵（Fc）基本上沒有催化氧化的能力，EDTA-Fe（EF）的催化氧化能力相對較弱。

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 陳小夏,何冰;茶多酚清除氧自由基與抗脂質過氧化作用[J];中藥材;1998年03期

本文編號：2723815