【摘要】：肝臟纖維化是威脅人類健康的重大疾病。長期飲酒、脂肪肝和慢性病毒性肝炎感染是可能引起肝臟纖維化的三個重要原因。肝臟發(fā)生纖維化是許多慢性肝病發(fā)展的終末狀態(tài),嚴重的肝臟纖維化將導致肝硬化甚至肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的發(fā)生。肝臟纖維化過程中有許多細胞參與,包括肝臟實質(zhì)細胞與非實質(zhì)細胞。其中最受關(guān)注的效應(yīng)細胞是肝臟星形細胞(hepatic stellate cell, HSC),HSC活化后分泌大量的膠原,導致細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的大量累積。近年也有研究發(fā)現(xiàn),肝實質(zhì)細胞也參與了肝臟纖維化。同時,眾所周知肝臟具有天然免疫的優(yōu)勢狀態(tài),這些在肝臟中大量存在的天然免疫細胞或多或少影響了肝臟纖維化的發(fā)展。 我國擁有大量的乙肝(Hepatitis B virus, HBV)攜帶者,乙肝病毒感染是導致患者發(fā)生肝臟纖維化的重要原因。乙肝感染如何加速肝臟纖維化,肝臟中的免疫細胞如何參與其中尚無定論,其中一個重要原因是缺少可以利用的小鼠模型。在本文研究中,我們對C57BL/6鼠和HBV轉(zhuǎn)基因(HBV-tg)鼠長期用肝臟毒物四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)誘導肝臟纖維化,對肝臟損傷、病理學和纖維化相關(guān)分子進行檢測,在機制研究中采用細胞群體的比例和數(shù)目分析、細胞清除、純化、轉(zhuǎn)輸、HSC與NKT細胞共培養(yǎng)、分離肝實質(zhì)細胞進行原代培養(yǎng)等方法。通過上述研究手段,我們?nèi)〉玫闹饕Y(jié)果是: 1、HBV-tg鼠可以自發(fā)肝臟纖維化 通過檢測肝臟損傷(alanine aminotransferase ,ALT,病理HE染色),我們發(fā)現(xiàn)六個月大的HBV-tg鼠肝損傷明顯比相同年齡的對照鼠C57BL/6嚴重。對肝臟切片的天狼猩紅(Sirius Red)染色和纖維化相關(guān)分子的熒光定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)六個月大的HBV-tg鼠與C57BL/6鼠相比明顯自發(fā)肝臟纖維化。 2、HBV-tg鼠對CCl4長期誘導的肝臟纖維化更加敏感 每周兩次注射CCl4連續(xù)注射2周-14周誘導C57BL/6鼠和HBV-tg鼠產(chǎn)生肝臟纖維化。發(fā)現(xiàn)HBV-tg鼠的肝臟纖維化更加嚴重。我們首次發(fā)現(xiàn),HBV-tg鼠可以作為很好的模擬人的乙肝攜帶者發(fā)展為肝臟纖維化的小鼠模型。 3、HBV-tg鼠NKT細胞通過活化HSC促進了肝臟纖維化 研究發(fā)現(xiàn),給Rag1-/-鼠轉(zhuǎn)輸來自HBV-tg鼠的淋巴細胞可以引起Rag1-/-鼠肝臟纖維化,而轉(zhuǎn)輸來自C57BL/6鼠的淋巴細胞則不可以。進一步研究發(fā)現(xiàn),在急性或慢性CCl4誘導下,HBV-tg鼠的肝臟NK細胞和NKT細胞比例和數(shù)目均比C57BL/6鼠多。通過細胞清除、轉(zhuǎn)輸?shù)葘嶒灠l(fā)現(xiàn),HBV-tg鼠的肝臟NKT細胞對HSC活化具有促進作用。同時NKT細胞也促進了纖維化相關(guān)分子表達,從而加重了HBV-tg鼠的肝臟纖維化。 4、NKT細胞通過分泌細胞因子促進HSC的活化 NKT細胞怎樣活化HSC?我們發(fā)現(xiàn)與C57BL/6鼠相比,HBV-tg鼠在CCl_4刺激下肝臟NKT細胞總數(shù)增多,同時分泌細胞因子IFN-γ,IL-4和IL-13的NKT細胞數(shù)目增多。將HBV-tg鼠通過流式分選出的肝臟NKT細胞,與通過肝臟灌流分離出來的HSC共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)NKT細胞可以活化HSC。如果在共培養(yǎng)體系中加入抗IL-4和IL-13的中和抗體,這種活化作用會消失;如果加入抗IFN-γ的中和抗體沒有這種作用。說明NKT細胞通過分泌Th2類細胞因子(eg,IL-4,IL-13)活化HSC。 5、HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細胞可以自發(fā)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchyma-transition,EMT) HBV-tg鼠中除了NKT細胞對肝臟纖維化具有促進作用,我們發(fā)現(xiàn)其肝實質(zhì)細胞也發(fā)揮了促進作用。來自六個月大的C57BL/6鼠和HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細胞通過肝臟灌流分離出來體外培養(yǎng),可以明顯看出來自HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細胞比來自C57BL/6鼠的肝實質(zhì)細胞表現(xiàn)出更顯著的間質(zhì)細胞表型。經(jīng)過定量PCR檢測EMT的標志分子波形蛋白(vimentin),發(fā)現(xiàn)其在HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細胞中表達上調(diào),更加證明HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細胞可以自發(fā)EMT。對兩種鼠分離得到的肝實質(zhì)細胞進行纖維化相關(guān)分子檢測,發(fā)現(xiàn)這些分子在六個月大的HBV-tg鼠中表達增高,表明HBV-tg鼠肝實質(zhì)細胞發(fā)生EMT對肝臟纖維化具有促進作用。 6、HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細胞在CCl_4誘導纖維化過程中通過發(fā)生EMT促進纖維化的發(fā)生 對CCl_4誘導肝臟纖維化的HBV-tg鼠和C57BL/6鼠原代分離肝實質(zhì)細胞進行體外培養(yǎng),在不同的時間點進行拍照比較,可以看出來自HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細胞具有更加典型的成纖維細胞表型,進一步通過定量PCR檢測vimentin,HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細胞表達vimentin增加,說明HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細胞在誘導肝臟纖維化過程中更容易發(fā)生EMT。對纖維化相關(guān)分子檢測,也發(fā)現(xiàn)在某些時間點這些分子表達上調(diào)。這個結(jié)果說明在CCl_4誘導肝臟纖維化過程中,肝實質(zhì)細胞也起到促進作用。 7、NK細胞具有抑制HBV-tg鼠EMT的作用 我們發(fā)現(xiàn)對HBV-tg鼠注射CCl_4 24小時,肝臟EMT標志分子vimentin表達會增高。通過細胞清除實驗發(fā)現(xiàn)NK細胞對EMT具有一定的抑制作用。推測NK細胞可能通過作用在CCl_4誘導下肝實質(zhì)細胞表達上調(diào)的DR5發(fā)揮抑制作用。 8、HBV-tg鼠發(fā)生EMT對乙肝誘發(fā)肝癌具有促進作用 我們發(fā)現(xiàn)HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細胞容易發(fā)生EMT。最新的研究顯示,EMT對癌癥發(fā)生具有促進作用。同時我們發(fā)現(xiàn)HBV-tg鼠晚期會自發(fā)肝臟腫瘤;通過每周兩次CCl_4注射連續(xù)誘導14周的HBV-tg鼠全部發(fā)生肝臟腫瘤。所以我們提出HBV-tg鼠也是一種研究乙肝導致肝癌的很好模型。 結(jié)論:HBV-tg鼠是研究乙肝攜帶加速肝臟纖維化的重要小鼠模型。HBV-tg鼠的免疫細胞對肝臟纖維化具有促進作用,其中肝臟NKT細胞主要通過分泌細胞因子活化HSC。另一方面,HBV-tg鼠的肝實質(zhì)細胞通過發(fā)生EMT參與肝臟纖維化,并對肝癌發(fā)生具有促進作用。
【學位授予單位】：中國科學技術(shù)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R575.2
【圖文】：

第一章 緒論：肝臟纖維化的效應(yīng)細胞及免疫學機制沒有對人體進行創(chuàng)傷，是診斷早期肝臟纖維化的重要依據(jù)，但是與肝組織活檢比準確率降低。近年來一些成像技術(shù)的運用可以作為對人體沒有創(chuàng)傷的檢測段，比如瞬時超聲檢測肝臟彈性的測試儀（FibroScan; Echosens, Paris, France以通過檢測肝臟彈性推測發(fā)生硬變的程度 (Castera L, Vergniol J, et al. 20Sebastiani G, Vario A, et al. 2006)。位論文全文數(shù)據(jù)庫 2011年 第09期 醫(yī)藥衛(wèi)生科技輯

第一章 緒論：肝臟纖維化的效應(yīng)細胞及免疫學機制時間快，識別具有光譜性、特異性不強，是人體免疫系統(tǒng)的第一道防線。由于人們以前對天然免疫的認識相對局限于天然免疫發(fā)生短期的免疫應(yīng)答，先于獲得性免疫。對天然免疫在肝臟慢性的纖維化疾病進程中的認識是很局限的。研究天然免疫對肝臟纖維化的影響，可以為肝臟纖維化的預防和治療提供思路。本綜述以肝臟纖維化的效應(yīng)細胞及天然免疫系統(tǒng)對肝臟纖維化的影響為出發(fā)點，結(jié)合在臨床中大量出現(xiàn)的 HBV 感染加快肝臟纖維化的現(xiàn)象進行介紹。靳自學：HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟纖維化的免疫學機制研究

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本文編號：2722611