發(fā)布時(shí)間：2020-06-20 15:23

【摘要】：肝臟纖維化是威脅人類健康的重大疾病。長(zhǎng)期飲酒、脂肪肝和慢性病毒性肝炎感染是可能引起肝臟纖維化的三個(gè)重要原因。肝臟發(fā)生纖維化是許多慢性肝病發(fā)展的終末狀態(tài),嚴(yán)重的肝臟纖維化將導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的發(fā)生。肝臟纖維化過(guò)程中有許多細(xì)胞參與,包括肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。其中最受關(guān)注的效應(yīng)細(xì)胞是肝臟星形細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC),HSC活化后分泌大量的膠原,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的大量累積。近年也有研究發(fā)現(xiàn),肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞也參與了肝臟纖維化。同時(shí),眾所周知肝臟具有天然免疫的優(yōu)勢(shì)狀態(tài),這些在肝臟中大量存在的天然免疫細(xì)胞或多或少影響了肝臟纖維化的發(fā)展。 我國(guó)擁有大量的乙肝(Hepatitis B virus, HBV)攜帶者,乙肝病毒感染是導(dǎo)致患者發(fā)生肝臟纖維化的重要原因。乙肝感染如何加速肝臟纖維化,肝臟中的免疫細(xì)胞如何參與其中尚無(wú)定論,其中一個(gè)重要原因是缺少可以利用的小鼠模型。在本文研究中,我們對(duì)C57BL/6鼠和HBV轉(zhuǎn)基因(HBV-tg)鼠長(zhǎng)期用肝臟毒物四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)誘導(dǎo)肝臟纖維化,對(duì)肝臟損傷、病理學(xué)和纖維化相關(guān)分子進(jìn)行檢測(cè),在機(jī)制研究中采用細(xì)胞群體的比例和數(shù)目分析、細(xì)胞清除、純化、轉(zhuǎn)輸、HSC與NKT細(xì)胞共培養(yǎng)、分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)等方法。通過(guò)上述研究手段,我們?nèi)〉玫闹饕Y(jié)果是: 1、HBV-tg鼠可以自發(fā)肝臟纖維化 通過(guò)檢測(cè)肝臟損傷(alanine aminotransferase ,ALT,病理HE染色),我們發(fā)現(xiàn)六個(gè)月大的HBV-tg鼠肝損傷明顯比相同年齡的對(duì)照鼠C57BL/6嚴(yán)重。對(duì)肝臟切片的天狼猩紅(Sirius Red)染色和纖維化相關(guān)分子的熒光定量PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)六個(gè)月大的HBV-tg鼠與C57BL/6鼠相比明顯自發(fā)肝臟纖維化。 2、HBV-tg鼠對(duì)CCl4長(zhǎng)期誘導(dǎo)的肝臟纖維化更加敏感 每周兩次注射CCl4連續(xù)注射2周-14周誘導(dǎo)C57BL/6鼠和HBV-tg鼠產(chǎn)生肝臟纖維化。發(fā)現(xiàn)HBV-tg鼠的肝臟纖維化更加嚴(yán)重。我們首次發(fā)現(xiàn),HBV-tg鼠可以作為很好的模擬人的乙肝攜帶者發(fā)展為肝臟纖維化的小鼠模型。 3、HBV-tg鼠NKT細(xì)胞通過(guò)活化HSC促進(jìn)了肝臟纖維化 研究發(fā)現(xiàn),給Rag1-/-鼠轉(zhuǎn)輸來(lái)自HBV-tg鼠的淋巴細(xì)胞可以引起Rag1-/-鼠肝臟纖維化,而轉(zhuǎn)輸來(lái)自C57BL/6鼠的淋巴細(xì)胞則不可以。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在急性或慢性CCl4誘導(dǎo)下,HBV-tg鼠的肝臟NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞比例和數(shù)目均比C57BL/6鼠多。通過(guò)細(xì)胞清除、轉(zhuǎn)輸?shù)葘?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HBV-tg鼠的肝臟NKT細(xì)胞對(duì)HSC活化具有促進(jìn)作用。同時(shí)NKT細(xì)胞也促進(jìn)了纖維化相關(guān)分子表達(dá),從而加重了HBV-tg鼠的肝臟纖維化。 4、NKT細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子促進(jìn)HSC的活化 NKT細(xì)胞怎樣活化HSC?我們發(fā)現(xiàn)與C57BL/6鼠相比,HBV-tg鼠在CCl_4刺激下肝臟NKT細(xì)胞總數(shù)增多,同時(shí)分泌細(xì)胞因子IFN-γ,IL-4和IL-13的NKT細(xì)胞數(shù)目增多。將HBV-tg鼠通過(guò)流式分選出的肝臟NKT細(xì)胞,與通過(guò)肝臟灌流分離出來(lái)的HSC共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)NKT細(xì)胞可以活化HSC。如果在共培養(yǎng)體系中加入抗IL-4和IL-13的中和抗體,這種活化作用會(huì)消失;如果加入抗IFN-γ的中和抗體沒(méi)有這種作用。說(shuō)明NKT細(xì)胞通過(guò)分泌Th2類細(xì)胞因子(eg,IL-4,IL-13)活化HSC。 5、HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞可以自發(fā)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchyma-transition,EMT) HBV-tg鼠中除了NKT細(xì)胞對(duì)肝臟纖維化具有促進(jìn)作用,我們發(fā)現(xiàn)其肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞也發(fā)揮了促進(jìn)作用。來(lái)自六個(gè)月大的C57BL/6鼠和HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞通過(guò)肝臟灌流分離出來(lái)體外培養(yǎng),可以明顯看出來(lái)自HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞比來(lái)自C57BL/6鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出更顯著的間質(zhì)細(xì)胞表型。經(jīng)過(guò)定量PCR檢測(cè)EMT的標(biāo)志分子波形蛋白(vimentin),發(fā)現(xiàn)其在HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),更加證明HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞可以自發(fā)EMT。對(duì)兩種鼠分離得到的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行纖維化相關(guān)分子檢測(cè),發(fā)現(xiàn)這些分子在六個(gè)月大的HBV-tg鼠中表達(dá)增高,表明HBV-tg鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)生EMT對(duì)肝臟纖維化具有促進(jìn)作用。 6、HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在CCl_4誘導(dǎo)纖維化過(guò)程中通過(guò)發(fā)生EMT促進(jìn)纖維化的發(fā)生 對(duì)CCl_4誘導(dǎo)肝臟纖維化的HBV-tg鼠和C57BL/6鼠原代分離肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行拍照比較,可以看出來(lái)自HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有更加典型的成纖維細(xì)胞表型,進(jìn)一步通過(guò)定量PCR檢測(cè)vimentin,HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表達(dá)vimentin增加,說(shuō)明HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在誘導(dǎo)肝臟纖維化過(guò)程中更容易發(fā)生EMT。對(duì)纖維化相關(guān)分子檢測(cè),也發(fā)現(xiàn)在某些時(shí)間點(diǎn)這些分子表達(dá)上調(diào)。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明在CCl_4誘導(dǎo)肝臟纖維化過(guò)程中,肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞也起到促進(jìn)作用。 7、NK細(xì)胞具有抑制HBV-tg鼠EMT的作用 我們發(fā)現(xiàn)對(duì)HBV-tg鼠注射CCl_4 24小時(shí),肝臟EMT標(biāo)志分子vimentin表達(dá)會(huì)增高。通過(guò)細(xì)胞清除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞對(duì)EMT具有一定的抑制作用。推測(cè)NK細(xì)胞可能通過(guò)作用在CCl_4誘導(dǎo)下肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表達(dá)上調(diào)的DR5發(fā)揮抑制作用。 8、HBV-tg鼠發(fā)生EMT對(duì)乙肝誘發(fā)肝癌具有促進(jìn)作用 我們發(fā)現(xiàn)HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞容易發(fā)生EMT。最新的研究顯示,EMT對(duì)癌癥發(fā)生具有促進(jìn)作用。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)HBV-tg鼠晚期會(huì)自發(fā)肝臟腫瘤;通過(guò)每周兩次CCl_4注射連續(xù)誘導(dǎo)14周的HBV-tg鼠全部發(fā)生肝臟腫瘤。所以我們提出HBV-tg鼠也是一種研究乙肝導(dǎo)致肝癌的很好模型。 結(jié)論:HBV-tg鼠是研究乙肝攜帶加速肝臟纖維化的重要小鼠模型。HBV-tg鼠的免疫細(xì)胞對(duì)肝臟纖維化具有促進(jìn)作用,其中肝臟NKT細(xì)胞主要通過(guò)分泌細(xì)胞因子活化HSC。另一方面,HBV-tg鼠的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞通過(guò)發(fā)生EMT參與肝臟纖維化,并對(duì)肝癌發(fā)生具有促進(jìn)作用。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R575.2
【圖文】：

第一章 緒論：肝臟纖維化的效應(yīng)細(xì)胞及免疫學(xué)機(jī)制沒(méi)有對(duì)人體進(jìn)行創(chuàng)傷，是診斷早期肝臟纖維化的重要依據(jù)，但是與肝組織活檢比準(zhǔn)確率降低。近年來(lái)一些成像技術(shù)的運(yùn)用可以作為對(duì)人體沒(méi)有創(chuàng)傷的檢測(cè)段，比如瞬時(shí)超聲檢測(cè)肝臟彈性的測(cè)試儀（FibroScan; Echosens, Paris, France以通過(guò)檢測(cè)肝臟彈性推測(cè)發(fā)生硬變的程度 (Castera L, Vergniol J, et al. 20Sebastiani G, Vario A, et al. 2006)。位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 2011年 第09期 醫(yī)藥衛(wèi)生科技輯

第一章 緒論：肝臟纖維化的效應(yīng)細(xì)胞及免疫學(xué)機(jī)制時(shí)間快，識(shí)別具有光譜性、特異性不強(qiáng)，是人體免疫系統(tǒng)的第一道防線。由于人們以前對(duì)天然免疫的認(rèn)識(shí)相對(duì)局限于天然免疫發(fā)生短期的免疫應(yīng)答，先于獲得性免疫。對(duì)天然免疫在肝臟慢性的纖維化疾病進(jìn)程中的認(rèn)識(shí)是很局限的。研究天然免疫對(duì)肝臟纖維化的影響，可以為肝臟纖維化的預(yù)防和治療提供思路。本綜述以肝臟纖維化的效應(yīng)細(xì)胞及天然免疫系統(tǒng)對(duì)肝臟纖維化的影響為出發(fā)點(diǎn)，結(jié)合在臨床中大量出現(xiàn)的 HBV 感染加快肝臟纖維化的現(xiàn)象進(jìn)行介紹。靳自學(xué)：HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟纖維化的免疫學(xué)機(jī)制研究

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本文編號(hào)：2722611