【摘要】：急性肝損傷是臨床常見的急性肝臟疾病之一,其發(fā)病原因主要包括藥物過量、毒性物質(zhì)暴露、肝炎病毒感染以及手術(shù)所致的缺血再灌注損傷。嚴(yán)重的急性肝損傷可導(dǎo)致急性肝衰竭危及患者生命。雖然急性肝損傷的發(fā)病機制尚未闡明,但免疫炎性反應(yīng)的激活在其中發(fā)揮了極其重要的作用。巨噬細胞作為肝臟內(nèi)數(shù)量最多的先天免疫細胞是維持肝臟免疫平衡的重要因素。不同類型的損傷因素可激活巨噬細胞啟動肝內(nèi)免疫炎性反應(yīng),從而進一步加重肝臟損傷。因此如何調(diào)控巨噬細胞的促炎性反應(yīng)是目前急性肝損傷研究的熱點和難點。本課題旨在通過基因敲除和藥物干擾兩個手段分析和探究巨噬細胞功能的調(diào)控在兩種不同類型的急性肝損傷中的作用及其機制。本課題的研究將為調(diào)控巨噬細胞的免疫炎性反應(yīng)在治療急性肝損傷中的應(yīng)用提供新的思路和理論基礎(chǔ)。課題分為以下兩個部分:第一部分TGR5/Cat E信號通路調(diào)控巨噬細胞的遷移和極化在肝臟缺血再灌注損傷中的作用和機制研究研究背景:肝內(nèi)的免疫炎性反應(yīng)是肝臟缺血再灌注(ischemia/reperfusion,IR)損傷的主要原因之一,巨噬細胞介導(dǎo)的促炎性反應(yīng)是其中重要的因素。許多研究表明G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體(bile acid-responsive G-protein-coupled receptor,TGR5)在先天免疫調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。我們課題組前期研究證實,TGR5能夠抑制IR后的肝內(nèi)炎性反應(yīng)從而保護肝臟IR損傷,但是其具體的機制仍不清楚。研究目的:研究TGR5調(diào)控巨噬細胞的促炎性反應(yīng)在肝臟IR損傷中的作用和機制。方法:我們采用野生型小鼠(wild type,WT)和TGR5基因敲除(TGR5~(-/-))小鼠構(gòu)建骨髓移植嵌合體如下:WT→WT(髓系細胞和非髓系細胞均表達TGR5)、WT→TGR5~(-/-)(僅在髓系細胞表達TGR5)、TGR5~(-/-)→WT(僅在非髓系細胞表達TGR5),并建立小鼠肝臟IR損傷模型,研究TGR5在骨髓來源巨噬細胞(bone marrow derived macrophages,BMDMs)中的激活對肝臟IR損傷的作用及其機制。利用基因芯片技術(shù),分析了脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)激活后TGR5~(-/-)BMDMs和WT BMDMs之間的差異表達基因譜。將連續(xù)10位準(zhǔn)備進行肝部分切除術(shù)需第一肝門阻斷的患者隨機分為口服熊去氧膽酸組(5人)和口服安慰劑組(5人),采取患者術(shù)前1h和術(shù)后24h的外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)進行流式細胞術(shù)分析。結(jié)果:TGR5~(-/-)→WT嵌合體小鼠的肝臟IR損傷以及肝內(nèi)的免疫炎性反應(yīng)與WT→WT、WT→TGR5~(-/-)嵌合體小鼠相比明顯加重。LPS體外活化TGR5~(-/-)BMDMs和WT BMDMs后,TGR5~(-/-)BMDMs遷移能力更強,并且更容易向促炎性巨噬細胞(M1)極化。TGR5激活劑INT-777在體內(nèi)、體外均能明顯增強TGR5的抑炎性效果。基因芯片檢測LPS活化后的TGR5~(-/-)BMDMs和WT BMDMs的差異表達基因譜,結(jié)果顯示TGR5~(-/-)BMDMs相比于WT BMDMs分泌細胞因子的能力和趨化性明顯增強。組織蛋白酶E(cathepsin E,Cat E)是TGR5~(-/-)BMDMs中上調(diào)表達最明顯的基因。利用siRNA干擾技術(shù)敲低TGR5~(-/-)BMDMs中Cat E的表達能夠明顯抑制TGR5~(-/-)BMDMs的遷移能力和M1極化。并且,體內(nèi)巨噬細胞靶向性敲低Cat E同樣能夠減輕TGR5~(-/-)→WT嵌合體小鼠的肝臟IR損傷以及肝內(nèi)的免疫炎性反應(yīng)。肝門阻斷患者PBMCs的流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,肝臟的IR明顯激活了人外周巨噬細胞的TGR5表達,并且與巨噬細胞的抑炎性極化(M2)趨勢相符�？诜苋パ跄懰岽龠M了術(shù)前、術(shù)后人外周巨噬細胞TGR5的激活與M2極化。結(jié)論:TGR5能夠抑制巨噬細胞的遷移能力和M1極化從而減輕IR后肝內(nèi)的免疫炎性反應(yīng),在肝臟IR損傷中發(fā)揮保護作用。TGR5限制巨噬細胞促炎性反應(yīng)的作用是通過抑制Cat E實現(xiàn)的。靶向TGR5/Cat E信號通路可能為治療肝臟IR損傷提供新的治療思路。第二部分精胺調(diào)控肝臟巨噬細胞的免疫應(yīng)答在急性肝損傷中的作用及機制研究研究背景:肝臟內(nèi)巨噬細胞(Kupffer cells,KCs)在毒性物質(zhì)所致的急性肝損傷中發(fā)揮重要的作用。最新研究發(fā)現(xiàn)自噬在不同炎性環(huán)境下具有調(diào)控巨噬細胞M1/M2極化的功能。精胺是多胺的一種,具有抗氧化、抗衰老的作用。越來越多的研究表明精胺能夠促進自噬在一些組織和細胞損傷中起到保護作用,但是其在急性肝損傷中的作用和機制尚不清楚。研究目的:探索精胺調(diào)控肝臟巨噬細胞介導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)在硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)導(dǎo)致的急性肝損傷中的作用和機制。方法:采用腹腔注射TAA的方法建立小鼠急性肝損傷的模型。肝組織HE染色和免疫組化分別觀察精胺預(yù)處理對TAA誘導(dǎo)的急性肝損傷以及對肝內(nèi)炎性反應(yīng)的影響。分離TAA處理后的肝臟KCs體外培養(yǎng),在體外觀察精胺對TAA誘導(dǎo)的KCs炎性反應(yīng)的調(diào)控作用及其對KCs自噬的影響。體內(nèi)、體外利用巨噬細胞靶向si RNA干擾技術(shù)探索精胺調(diào)控KCs自噬在TAA誘導(dǎo)的急性肝損傷中的作用。結(jié)果:精胺預(yù)處理能明顯減輕TAA誘導(dǎo)的急性肝損傷,并且能明顯抑制肝內(nèi)炎性反應(yīng)。分離TAA處理后小鼠肝臟KCs進行體外實驗,發(fā)現(xiàn)TAA可誘導(dǎo)KCs向M1型極化,增強KCs的促炎性反應(yīng)。精胺能抑制TAA刺激后的KCs向M1型極化而促進其向M2型極化,表現(xiàn)為M1型基因(IL-1β、i NOS)表達下調(diào)和M2型基因(Arg-1、Mrc-1)表達上調(diào),以及KCs分泌的促炎性細胞因子(TNF-α、IL-6)減少而抑炎性細胞因子(IL-10)增多。精胺能夠通過激活A(yù)TG5促進TAA刺激后KCs的自噬,表現(xiàn)為LC3B-II的蛋白水平增高,p62的蛋白水平降低,氯喹(chloroquine,CQ)能夠顯著阻斷精胺誘導(dǎo)的KCs自噬流。體內(nèi)、體外采用ATG5-si RNA干擾ATG5在KCs中的表達均能明顯抑制精胺的抑炎性效果和對TAA誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護作用。結(jié)論:在TAA誘導(dǎo)的急性肝損傷中,精胺可通過激活A(yù)TG5引發(fā)KCs的自噬從而抑制其向M1型極化而促進其向M2型極化,起到抑制肝內(nèi)的炎性反應(yīng)、減輕肝損傷的作用。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575
【圖文】：

24圖 1.髓系細胞中 TGR5 的激活保護肝臟 IR 損傷。各組骨髓嵌合體小鼠建立肝臟IR 模型，于再灌注 6h 后收集血清和肝臟組織。A.血清 ALT 水平；B.血清 AST 水平；C.肝臟組織 HE 染色；D.Suzuki 評分；E.肝臟組織 TUNEL 染色；F.凋亡細胞計數(shù)。（*P<0.05）

1 髓系細胞中 TGR5 的激活減輕了肝臟 IR 后的炎性反應(yīng)。各組骨髓嵌立肝臟 IR 模型，于再灌注 6h 后收集血清。A.PCR 檢測肝臟組織中炎 TNF-α 、IL-6、CXCL-10、IL-10 基因表達水平。B.ELISA 檢測血清 TNF-α 、IL-6、IL-10 的水平；臟損傷時肝內(nèi)的巨噬細胞數(shù)量明顯增加，主要原因是髓系單核細胞中趨化因子的作用下被募集到肝內(nèi)的損傷部位，并且在局部微環(huán)境化而來。因此，我們利用免疫組化檢測肝內(nèi)的巨噬細胞數(shù)量的變化2A、B 所示，在肝臟 IR 后，肝內(nèi)的 CD11b+巨噬細胞數(shù)量較 Sham 組明在 TGR5-/-→WT 組小鼠肝臟內(nèi) CD11b+巨噬細胞數(shù)量明顯多于 WT→WTGR5-/-組。并且 INT-777 能有效地減少肝臟 IR 后 WT→WT 組和 WT→T的 CD11b+巨噬細胞數(shù)量，而對 TGR5-/-→WT 組無明顯作用。

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本文編號：2722561