發(fā)布時間：2020-06-20 15:31

【摘要】：研究背景和目的:肝纖維化是各種急性或慢性肝臟損傷所導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在肝組織間質(zhì)中過度沉積的病理學(xué)改變,是慢性肝病向肝纖維化、肝硬化進(jìn)展的共同環(huán)節(jié),抑制此環(huán)節(jié)的進(jìn)展對預(yù)防肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)展有極為重要的意義。肝纖維化是一個極為復(fù)雜的病理過程,包含多個信號通路和細(xì)胞因子共同參與,但其確切機(jī)制尚未完全闡明。其中,位于肝臟“Disse隙”中的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化、增殖、遷移、分泌細(xì)胞因子及ECM等特性是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的主要環(huán)節(jié)。非選擇性β受體阻滯劑(Non-Selective Beta Blocker,NSBB),是肝硬化門靜脈高壓藥物治療的“基石”,可通過β1受體阻滯降低心臟輸出量和β2受體阻滯收縮內(nèi)臟血管,減少門靜脈血流量,從而降低門靜脈壓力。普洛萘爾是第一個用于預(yù)防肝硬化食管胃靜脈曲張出血的的NSBB,卡維地洛(Carvedilol)是第三代NSBB,具有較強(qiáng)的非選擇性β受體阻滯作用和一定的α1受體阻滯作用。在傳統(tǒng)NSBB作用基礎(chǔ)上,卡維地洛的α1受體阻滯作用使得其不僅能減少心臟輸出量及降低門靜脈系統(tǒng)血流灌注量,同時還能降低肝內(nèi)血管阻力。因此臨床上卡維地洛較普萘洛爾具有更強(qiáng)的降低門靜脈壓力的作用�？ňS地洛在肝臟中是否具有緩解纖維化作用,既往亦有多項類似的研究,以往研究提示卡維地洛具有抗鼠肝纖維化、抑制鼠HSC增殖及致纖維化作用,而HSC的活化、增殖、遷移等特性又是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié),所以抑制HSC的活性有助于逆轉(zhuǎn)肝纖維化。同時,自噬和凋亡在HSC的活化中起著重要作用,細(xì)胞自噬(autophagy)指真核細(xì)胞通過溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)錯誤產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器來維持細(xì)胞穩(wěn)定狀態(tài)的過程,是細(xì)胞在應(yīng)激時能自我修復(fù)的重要生理活動之一。當(dāng)自噬被激活后,細(xì)胞將自身的受損細(xì)胞器和錯誤產(chǎn)生的蛋白質(zhì)以自噬體的形成運(yùn)送至溶酶體中發(fā)生酸性降解,使得細(xì)胞在營養(yǎng)匱乏時自我生成養(yǎng)料,提供能夠維持自身新陳代謝的能量,是一種細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制。細(xì)胞自噬和凋亡在HSC的活化過程中起著重要作用,增加HSC的凋亡或抑制其自噬可以顯著降低其活力和活化狀態(tài)。本研究旨在探究卡維地洛對于人肝星狀細(xì)胞LX-2自噬和凋亡的影響,并探究其潛在抑制肝纖維化的機(jī)制。研究方法:1.體外培養(yǎng)人肝星狀細(xì)胞系LX-2。2.Western blot驗證卡維地洛對HSC表達(dá)自噬上游標(biāo)志物(LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、Beclinl、Atg5)的影響。3.透射電鏡觀察卡維地洛作用下HSC中的自噬泡的形態(tài)。4.應(yīng)用相關(guān)自噬誘導(dǎo)劑和抑制劑使用細(xì)胞免疫熒光與Western blot驗證卡維地洛對于自噬流的影響。5.應(yīng)用相關(guān)自噬誘導(dǎo)劑和抑制劑使用細(xì)胞免疫熒光驗證卡維地洛對于HSC中自噬體與溶酶體共定位的影響。6.應(yīng)用相關(guān)自噬誘導(dǎo)劑和抑制劑使用細(xì)胞免疫熒光與Western blot驗證卡維地洛對于HSC中溶酶體pH值的影響。7.Western blot、流式細(xì)胞技術(shù)與CCK-8實(shí)驗驗證卡維地洛對HSC活性與增殖的影響。8.Western blot驗證卡維地洛對HSC凋亡相關(guān)信號通路蛋白cleaved-caspase8、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、BAX和Bcl-2 的影響。9.應(yīng)用相關(guān)自噬誘導(dǎo)劑和抑制劑使用Western blot與流式細(xì)胞技術(shù)探究卡維地洛作用下,HSC中自噬與凋亡的關(guān)系。研究結(jié)果:1.卡維地洛可增加HSC中LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ的轉(zhuǎn)化,但不影響B(tài)eclinl、Atg5的表達(dá)。2.透射電鏡顯示卡維地洛用藥組HSC中的自噬體數(shù)量明顯高于對照組。3.相比于卡維地洛用藥組,卡維地洛聯(lián)合應(yīng)用自噬早期抑制劑3-MA組HSC中自噬體數(shù)量明顯減少,而卡維地洛聯(lián)合應(yīng)用自噬晚期抑制劑氯喹(CQ)組自噬體數(shù)量相比于卡維地洛組無統(tǒng)計學(xué)差異。4.卡維地洛可增加HSC中自噬下游標(biāo)志物P62的表達(dá),雙標(biāo)腺病毒GFP-RFP-LC3B轉(zhuǎn)染顯示應(yīng)用卡維地洛后可增加HSC中自噬體的數(shù)量但無法增加自噬溶酶體的數(shù)量。5.單標(biāo)腺病毒GFP-LC3B轉(zhuǎn)染后顯示卡維地洛并不影響自噬體與溶酶體的結(jié)合。6.卡維地洛可升高HSC中的pH值。7.卡維地洛能抑制HSC的增殖,并呈時間、劑量依賴性,12小時IC50=25.10μ M,24小時IC50=18.16 μM。8.卡維地洛可以增加 HSC 中 cleaved-caspase8、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、BAX,減少Bcl-2的表達(dá)。9.卡維地洛作用6小時后HSC中自噬相關(guān)蛋白就已發(fā)生變化,但直到作用12小時后HSC中凋亡相關(guān)蛋白才發(fā)生變化。研究結(jié)論:卡維地洛可以抑制人HSC的自噬并促進(jìn)人HSC的凋亡,卡維地洛對自噬的抑制作用早于其對凋亡的作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575.2

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本文編號：2722617