發(fā)布時間：2020-06-18 17:58

【摘要】：【目的】構建含有靶向活化肝星狀細胞特異性啟動子的質粒，并于體外檢測其表達情況。 【方法】①利用聚合酶鏈式反應從PMIR-luciferase質粒中擴增得到目的基因——表達螢火蟲熒光素酶基因片段即luciferease基因以及MCS多克隆位點+PloyA尾巴片段，通過雙酶切將其連接克隆至含有α平滑肌肌動蛋白啟動子（αSMA啟動子）的Psmp8質粒載體中，構建Psmp8+Luciferase+MCS質粒，并進行酶切鑒定、基因測序證實。②利用膠原酶、鏈酶蛋白酶、DNA酶等灌注消化小鼠肝組織后，密度梯度離心法提取肝星狀細胞（HSCs）；HSC培養(yǎng)傳代自行活化后，進行針對αSMA的Westernblot及免疫熒光檢測。③Psmp8+Luciferase+MCS質粒及海腎熒光素酶質粒按20:1比例混合后分別轉染HSCs、小鼠肝細胞系AML12、小鼠庫弗細胞系RAW264.7作為實驗組，peGFP質粒及海腎熒光素質粒按20:1比例混合后分別轉染HSC、AML12、RAW264.7作為對照組，48h后雙熒光素酶報告基因檢測法檢測兩質粒表達情況。 【結果】①Psmp8+Luciferase+MCS質粒經(jīng)酶切及基因測序鑒定正確，成功構建了Psmp8+Luciferase質粒。②Western blot及免疫熒光檢測示所提取細胞培養(yǎng)傳代后可表達αSMA。③雙熒光素酶報告基因檢測顯示Psmp8+Luciferase+MCS質粒中螢火蟲熒光素酶基因可在活化HSCs中表達而不在AML12、RAW264.7中表達，對照組中無螢火蟲熒光素酶基因表達。 【結論】Psmp8+Luciferase+MCS質粒所含αSMA啟動子可靶向性在活化HSCs中表達，據(jù)此可以此質粒為載體構建靶向活化HSCs的質粒，進而用于基因治療或其他實驗研究。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R575.2

【共引文獻】

相關期刊論文 前10條

1 唐琳;孫航;張林;郭暉;張玲;劉杞;;阻斷肝再生增強因子的表達對人肝癌細胞株HepG2增殖的抑制作用[J];癌癥;2006年06期

2 ;The Roles of Innate Immune Cells in Liver Injury and Regeneration[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年04期

3 張玲,廖曉輝,劉杞,宋曉英;肝再生增強因子在急性腎衰大鼠模型腎組織中的表達及意義[J];重慶醫(yī)學;2003年06期

4 孔祥平;易學瑞;;肝再生增強因子研究進展[J];傳染病信息;2008年02期

5 吳貽琛;辛紹杰;;肝再生增強因子研究進展[J];傳染病信息;2012年01期

6 申海菊 ,張陽德 ,劉曉冬 ,楊林 ,黃秋林 ,賈曉魏;人肝細胞再生增強因子克隆及序列分析[J];中國醫(yī)師雜志;2002年09期

7 李青,張麗梅,劉殿武,賀宇彤,肖永紅,何海艷;肝再生增強因子重組質粒對肝纖維化大鼠的實驗治療作用[J];第三軍醫(yī)大學學報;2005年08期

8 王志毅;張艷;石小楓;劉杞;;肝細胞移植聯(lián)合肝再生增強因子治療大鼠急性肝功能衰竭的研究[J];第三軍醫(yī)大學學報;2007年10期

9 張瀟;史雪川;;siRNA對體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細胞紅蛋白基因表達的抑制[J];中國兒童保健雜志;2011年01期

10 ;Construction of High Expression Plasmid of Human Augmenter of Liver Regeneration(hALR), Expression and Purification of hALR[J];Chemical Research in Chinese Universities;2006年02期

相關會議論文 前1條

1 Yaogang Zhong;Tianran Ma;Xiuxuan Sun;Wentian Chen;Yuan Hu;Yannan Qin;Peixin Zhang;Haoxiang Wu;Jihong Cui;Huijie Bian;Zheng Li;;Alteration and location of GalNAc-binding proteins in activated human hepatic stellate cells[A];第十一屆全國博士生學術年會（生物醫(yī)藥專題）論文集（中冊，墻報P1-P24）[C];2013年

相關博士學位論文 前10條

1 潘韻;重組人肝再生增強因子（rhALR）的表達、純化及生物活性研究[D];浙江大學;2003年

2 郝艷秋;人肝再生增強因子基因克隆、表達、生物活性及應用研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2003年

3 沈利;人類新基因BNIPL生物學功能的初步研究[D];復旦大學;2004年

4 唐琳;肝再生增強因子與肝癌發(fā)生、發(fā)展關系的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2005年

5 李力;人胎肝來源PACT等重要功能基因的基因打靶研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2005年

6 董忠軍;固有免疫細胞在肝臟損傷和再生中的效應機制[D];中國科學技術大學;2006年

7 林瑩;肝再生增強因子調控細胞增殖及其與鈉、鉀ATP酶關系研究[D];華南理工大學;2006年

8 石小楓;1.肝再生增強因子對外原性抗原引起機體免疫應答影響的初步研究 2.病毒性肝炎肝衰竭患者死亡原因分析 3.聚乙二醇化干擾素α-2a治療HBeAg陽性的慢性乙型肝炎及其應用于拉米夫定耐藥的初步臨床觀察[D];重慶醫(yī)科大學;2006年

9 鄧建川;人肝再生增強因子相互作用蛋白的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2006年

10 潘艷;人肝再生增強因子結構與功能的初步研究[D];吉林大學;2007年

相關碩士學位論文 前10條

1 王世美;TGF-β1及靶向Smad3基因shRNA慢病毒對大鼠肝細胞系BRL-3A增殖的作用[D];山西醫(yī)科大學;2011年

2 郭珊珊;重組人肝再生增強因子對5/6腎切除大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1和Ⅳ型膠原表達的影響[D];河北醫(yī)科大學;2011年

3 徐永紅;肝再生增強因子，細胞色素P450與HepG2在體外耐藥的關系[D];重慶醫(yī)科大學;2011年

4 張臣麗;重組人肝再生增強因子單克隆抗體的制備及臨床檢測的初步探索[D];重慶醫(yī)科大學;2011年

5 張進良;硫化氫對大鼠肝星狀細胞膠原Ⅰ和膠原Ⅲ表達的影響[D];青海大學;2011年

6 趙春麗;人肝再生增強因子基因的克隆、真核表達載體構建及原核表達[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2003年

7 張林;1.利用噬菌體表面展示技術構建人肝癌細胞的cDNA表達文庫 　2.從人肝癌細胞cDNA表達文庫中篩選hALR相互作用蛋白[D];重慶醫(yī)科大學;2004年

8 謝華;rALR對大鼠單個核細胞作用的初步研究[D];重慶醫(yī)科大學;2004年

9 廖曉輝;ALR對大鼠急性腎衰竭中腎小管上皮細胞的生物活性作用研究[D];重慶醫(yī)科大學;2004年

10 郭書權;睪丸組織及精液中肝再生增強因子的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2004年

本文編號：2719625