發(fā)布時(shí)間：2020-06-18 17:58

【摘要】：【目的】構(gòu)建含有靶向活化肝星狀細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的質(zhì)粒，并于體外檢測(cè)其表達(dá)情況。 【方法】①利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從PMIR-luciferase質(zhì)粒中擴(kuò)增得到目的基因——表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶基因片段即luciferease基因以及MCS多克隆位點(diǎn)+PloyA尾巴片段，通過(guò)雙酶切將其連接克隆至含有α平滑肌肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子（αSMA啟動(dòng)子）的Psmp8質(zhì)粒載體中，構(gòu)建Psmp8+Luciferase+MCS質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切鑒定、基因測(cè)序證實(shí)。②利用膠原酶、鏈酶蛋白酶、DNA酶等灌注消化小鼠肝組織后，密度梯度離心法提取肝星狀細(xì)胞（HSCs）；HSC培養(yǎng)傳代自行活化后，進(jìn)行針對(duì)αSMA的Westernblot及免疫熒光檢測(cè)。③Psmp8+Luciferase+MCS質(zhì)粒及海腎熒光素酶質(zhì)粒按20:1比例混合后分別轉(zhuǎn)染HSCs、小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12、小鼠庫(kù)弗細(xì)胞系RAW264.7作為實(shí)驗(yàn)組，peGFP質(zhì)粒及海腎熒光素質(zhì)粒按20:1比例混合后分別轉(zhuǎn)染HSC、AML12、RAW264.7作為對(duì)照組，48h后雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法檢測(cè)兩質(zhì)粒表達(dá)情況。 【結(jié)果】①Psmp8+Luciferase+MCS質(zhì)粒經(jīng)酶切及基因測(cè)序鑒定正確，成功構(gòu)建了Psmp8+Luciferase質(zhì)粒。②Western blot及免疫熒光檢測(cè)示所提取細(xì)胞培養(yǎng)傳代后可表達(dá)αSMA。③雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示Psmp8+Luciferase+MCS質(zhì)粒中螢火蟲(chóng)熒光素酶基因可在活化HSCs中表達(dá)而不在AML12、RAW264.7中表達(dá)，對(duì)照組中無(wú)螢火蟲(chóng)熒光素酶基因表達(dá)。 【結(jié)論】Psmp8+Luciferase+MCS質(zhì)粒所含αSMA啟動(dòng)子可靶向性在活化HSCs中表達(dá)，據(jù)此可以此質(zhì)粒為載體構(gòu)建靶向活化HSCs的質(zhì)粒，進(jìn)而用于基因治療或其他實(shí)驗(yàn)研究。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2719625