【摘要】： 目的:肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是各種原因所致的肝臟慢性疾病的共同病理過程,是慢性肝病發(fā)展為肝硬化的早期和必經(jīng)階段,抑制甚或逆轉(zhuǎn)肝纖維化向前發(fā)展極為重要。肝纖維化的形成涉及多種細(xì)胞、細(xì)胞因子及肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的變化。核因子-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)是一種廣泛存在于體內(nèi)多種細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子,與機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)及凋亡調(diào)控密切相關(guān),Bcl-2家族是它的下游基因,在細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控過程中起著至關(guān)重要的作用,Bcl-2家族成員構(gòu)成比例決定細(xì)胞存亡。姜黃素(curcumin)是從姜黃屬中藥分離出的主要藥理活性成分,具有抗炎、抗脂質(zhì)過氧化、抗腫瘤、保肝等多種藥理作用。近來研究發(fā)現(xiàn),血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitors,ACEI)對肝纖維化具有明顯抑制作用。本實(shí)驗(yàn)通過檢測CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型肝組織中NF-KB及相關(guān)凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá),研究姜黃素和依那普利單獨(dú)應(yīng)用和聯(lián)合應(yīng)用對肝纖維化的影響,探討這些指標(biāo)在肝纖維化發(fā)生中的機(jī)制,并為肝纖維化的治療提供新的靶點(diǎn)。 方法:8周齡雄性昆明種小鼠45只隨機(jī)分為5組,正常對照組(5只)、模型組(10只)、姜黃素治療組(10只)、依那普利治療組(10只)和姜黃素聯(lián)合依那普利治療組(10只)。除正常對照組外,各組小鼠均給予四氯化碳5ul/g體重腹腔注射建立肝纖維化模型,每周2次,共10周。姜黃素治療組、依那普利治療組和姜黃素聯(lián)合依那普利治療組(以后簡稱聯(lián)合治療組)小鼠分別從第二周到第十周給予姜黃素100ug/g、依那普利10mg/kg、及姜黃素100ug/g聯(lián)合依那普利10mg/kg體重,每周3次灌胃處理,正常對照組給予蒸餾水灌胃,每周3次。所有小鼠均于10周處死。留取血清檢測肝功能ALT、AST和血清肝纖維化指標(biāo)HA;留取部分肝組織,10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,蘇木精-伊紅(HE)染色及Masson染色觀察肝組織病理學(xué)改變,免疫組織化學(xué)染色方法檢測IKB、NF-kBP65、Bcl-2、Bax的含量,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測肝組織Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)。 結(jié)果: 1小鼠一般情況:正常組小鼠精神好,活動自如,毛發(fā)有光澤,每周體重增長正常。模型組小鼠隨著四氯化碳注射時(shí)間的延長,變得易激惹,精神萎靡,食欲下降,體重增長慢或不增,各治療組小鼠的情況優(yōu)于模型組。模型組、姜黃素治療組、依那普利治療組、聯(lián)合治療組、對照組小鼠體重依次為:34.43±4.08、43.38±4.75、43.56±2.88、49.75±3.62、53.60±3.51。10周末,與正常對照組相比,其他四組小鼠體重下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均0.05)。與模型組比較,其他四組小鼠體重增加明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值0.05);對照組及聯(lián)合治療組小鼠體重高于姜黃素治療組和依那普利治療組(P0.05);姜黃素治療組與依那普利治療組間、對照組與聯(lián)合治療組間小鼠體重比較無顯著差異(P 0.05)。 2小鼠血清學(xué)指標(biāo)檢測:實(shí)驗(yàn)動物血清ALT水平,模型組、依那普利治療組、姜黃素治療組、聯(lián)合治療組、正常對照組水平,依次為:155.29±21.56U/L,92.11±16.89U/L,83.75±14.54U/L,47.50±9.17U/L,26.60±5.22U/L。對照組及各治療組血清ALT水平均低于模型組(P0.05),聯(lián)合治療組效果優(yōu)于依那普利及姜黃素單藥治療組(P0.05),依那普利治療組與姜黃素治療組間血清ALT水平無顯著差異(P 0.05);血清AST水平,模型組、依那普利治療組、姜黃素治療組、聯(lián)合治療組、正常對照組,依次為:205.29±15.86U/L,123.22±10.47U/L,98.38±12.41U/L,79.88±9.83U/L,65.20±16.41 U/L,各組之間AST水平的兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;模型組、依那普利治療組、姜黃素治療組、聯(lián)合治療組、正常對照組,實(shí)驗(yàn)動物血清HA水平依次為:1680.22±94.19ng/ml,869.89±110.53ng/ml , 608.71±120.74ng/ml , 396.13±78.17ng/ml ,144.20±37.09ng/ml,各組之間HA水平的兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P 0.05。 3肝組織病理學(xué)檢測 3.1肝組織大體標(biāo)本形態(tài):正常對照組小鼠肝臟為紅褐色,柔軟,明亮有光澤;模型組小鼠肝臟大體色澤暗淡,表面欠光滑,體積較正常對照組減小,肝臟邊緣變鈍,質(zhì)地較實(shí),肝臟表面可見散在黃色脂肪顆粒;依那普利治療組、姜黃素治療組小鼠肝臟大體色澤偏暗,體積較正常對照組略有減小,聯(lián)合治療組小鼠肝臟紅褐色,有光澤,體積未見明顯縮小。 3.2肝組織病理HE染色:正常對照(G0)組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰,肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞索排列規(guī)則有序,肝細(xì)胞大小均勻,無變性、壞死;模型組(G3-G4)小鼠多數(shù)正常小葉結(jié)構(gòu)破壞或消失,由匯管區(qū)和中央靜脈伸出粗大膠原纖維條索分割,包繞肝小葉,肝細(xì)胞索排列紊亂,肝細(xì)胞濁腫明顯,壞死出血較多,纖維間隔內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤,部分可見假小葉形成;依那普利治療組和姜黃素治療組(G2-G3)可見匯管區(qū)有少量的纖維組織增生,未見假小葉形成,可見炎癥細(xì)胞浸潤,肝細(xì)胞水腫較模型組減輕;聯(lián)合治療組(G1-G2)優(yōu)于依那普利治療組和姜黃素治療組。 3.3肝組織病理Masson染色:顯微鏡下觀察綠色膠原纖維分布情況,正常對照組(S0)僅于血管周圍可見少量綠色纖維,細(xì)且短,肝小葉結(jié)構(gòu)正常,未見纖維增生;模型組(S3-S4)肝臟組織中纖維明顯增多,分布廣泛,可相互連接形成較粗大的纖維間隔,多位于匯管區(qū)和血管周圍;依那普利治療組及姜黃素治療組(S2-S3)可見較細(xì)的綠色纖維走行于血管周圍;聯(lián)合治療組(S1-S2)纖維化程度較依那普利治療組及姜黃素治療組輕。 4肝組織免疫組織化學(xué)染色 4.1肝組織bcl-2蛋白免疫組織化學(xué)染色:與空白陰性對照比較,以細(xì)胞和組織棕黃色染色或深棕黃色為陽性表達(dá)。在正常小鼠肝竇、肝細(xì)胞漿和中央靜脈呈低水平表達(dá),在模型組小鼠肝組織中分布廣泛,主要表達(dá)在匯管區(qū)、纖維間隔、肝竇、肝細(xì)胞膜、中央靜脈和肝細(xì)胞漿也有一定表達(dá)。五組bcl-2表達(dá)量:聯(lián)合治療組(1.31±0.51)%姜黃素治療組(1.17±0.41)%依那普利治療組(0.97±0.25)%模型組(0.70±0.36) %㧐正常對照組(0.58±0.34)%,兩兩比較,P 0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.2肝組織Bax蛋白免疫組織化學(xué)染色:與空白陰性對照比較,以細(xì)胞和組織染為棕黃色染色視為陽性表達(dá)。Bax在正常小鼠中央靜脈及其周圍的肝竇呈低水平表達(dá)。在肝纖維化模型小鼠肝組織中主要表達(dá)在肝細(xì)胞漿,主要為變性的肝細(xì)胞漿,嚴(yán)重時(shí)可呈彌漫性分布,其次在肝竇、纖維間隔和中央靜脈。五組bax表達(dá)量:模型組(1.52±0.20)%依那普利治療組(0.88±0.27)%姜黃素治療組(0.85±0.31)%聯(lián)合治療組(0.63±0.22)%正常對照組(0.25±0.20)%,兩兩比較,P 0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.3肝組織NF-κBp65蛋白免疫組織化學(xué)染色:NF-κBp65陽性物質(zhì)呈棕黃色顆粒,彌漫分布于細(xì)胞質(zhì)中,激活后位于細(xì)胞核中。在對照組小鼠肝組織中較少表達(dá)NF-κB p65,模型組則有較強(qiáng)的表達(dá),主要分布于肝細(xì)胞、HSC細(xì)胞,胞漿內(nèi)亦有表達(dá),各治療組NF-κB p65表達(dá)較對照組有所增加,且陽性表達(dá)主要位于肝細(xì)胞漿中,各組水平依次為:模型組(2.20±0.10)%依那普利治療組(1.18±0.13)%姜黃素治療組(0.95±0.07)%聯(lián)合治療組(0.62±0.06) %正常對照組(0.42±0.06)%。兩兩比較,P 0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.4肝組織IKB蛋白免疫組織化學(xué)染色:IκB在肝組織中的表達(dá)與NF-κB p65相似,在對照組小鼠肝組織中肝細(xì)胞漿內(nèi)有較弱的表達(dá),細(xì)胞核內(nèi)無表達(dá);在模型組及各治療組中肝細(xì)胞漿及胞核中可見彌漫性棕黃色顆粒表達(dá),聯(lián)合治療組以胞漿表達(dá)增多為主,胞核及HSC中也見陽性表達(dá),而模型組胞漿及胞核中表達(dá)均較聯(lián)合組明顯減少,各組水平依次為聯(lián)合治療組(2.20±0.14)%姜黃素治療組(1.35±0.12)%依那普利治療組(1.08±0.07)%模型組(0.94±0.13)%對照組(0.50±0.06)%。兩兩比較,P 0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5肝組織RT-PCR檢測 5.1肝組織bcl-2mRNA表達(dá):聯(lián)合治療組、姜黃素治療組、依那普利治療組、模型組、對照組,bcl-2mRNA表達(dá)水平明顯下降:聯(lián)合治療組(1.40±0.09)%姜黃素治療組(1.19±0.15)%依那普利治療組(0.87±0.12)%模型組(0.56±0.07)%正常對照組(0.30±0.09)%,五組間兩兩比較,P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.2肝組織bax mRNA表達(dá):模型組、依那普利治療、姜黃素治療組、聯(lián)合治療組、正常對照組bax mRNA表達(dá)水平明顯下降:模型組(1.06±0.14)%依那普利治療組(0.92±0.07)%姜黃素治療組(0.79±0.08)%聯(lián)合治療組(0.67±0.09)%正常對照組(0.51±0.10)%,五組間兩兩比較,P 0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6肝組織纖維化程度與肝組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的相關(guān)關(guān)系:Bax與纖維化程度呈正相關(guān),纖維化越重,Bax表達(dá)越多;Bcl-2/Bax的比值與纖維化程度呈負(fù)相關(guān),纖維化越重,比值越小。 結(jié)論: 1應(yīng)用10%CC14橄欖油溶液腹腔注射10周,可成功建立符合血清生化學(xué)和病理特征的小鼠肝纖維化模型。 2肝細(xì)胞凋亡是肝纖維化發(fā)病的重要機(jī)制之一,核因子NF-κB與Bcl-2基因家族與肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系最為密切。Bcl-2是最重要的抗凋亡因子,又被稱為“生存基因”。Bax基因是Bcl-2的同源基因,是最重要的促凋亡因子,兩者之間的比值決定細(xì)胞的生存或凋亡,Bcl-2/Bax比值增加,細(xì)胞凋亡減少,Bcl-2/Bax比值降低,細(xì)胞凋亡增加。Bax與纖維化程度呈正相關(guān),Bcl-2/Bax的比值與纖維化程度呈負(fù)相關(guān)。 3單用姜黃素及依那普利可以預(yù)防四氯化碳所致的小鼠肝纖維化的形成,姜黃素聯(lián)合依那普利應(yīng)用時(shí),對預(yù)防四氯化碳所致的小鼠肝纖維化效果最好,機(jī)理是通過抑制NF-κB活性進(jìn)而了抑制Bax的表達(dá),促進(jìn)Bcl-2的表達(dá),抑制了肝細(xì)胞凋亡,而減輕肝了纖維化。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R575.2

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