【摘要】：研究背景 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是嗜肝DNA病毒屬的一員。HBV可以引起肝臟的急、慢性感染,HBV的慢性感染是引起嚴(yán)重肝臟疾病的主要病因。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,全球20多億人曾感染乙肝病毒,其中3.5億以上為慢性乙型肝炎病毒感染者。慢性乙型肝炎不易徹底治愈,并且具有發(fā)展成肝硬化、肝癌的高度危險(xiǎn)性。慢性乙型肝炎(CHB)是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題,每年全世界范圍內(nèi)約有一百萬(wàn)人死于慢性乙型肝炎感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞肝癌。我國(guó)約有超過(guò)50%的居民曾被乙型肝炎病毒感染過(guò),其中8%-15%的人成為慢性感染者。 慢性乙型肝炎(CHB)治療的目標(biāo)是要實(shí)現(xiàn)的持續(xù)抑制HBV的復(fù)制,緩解肝臟疾病。乙型肝炎的治療取決于幾個(gè)因素,如疾病的階段,“e”抗原的存在或缺失、耐藥性、特別是在肝臟慢性疾病的終末期后期無(wú)有效藥物治療。因此,在治療時(shí)機(jī)的選擇及治療過(guò)程中對(duì)以上因素的評(píng)價(jià)是非常重要的。干擾素a-2a(IFN2a)和干擾素α-2b干擾素(IFN2b)作為首選的治療CHB已使用多年,治療的目標(biāo)是HBeAg血清轉(zhuǎn)換,以激活免疫反應(yīng),改變免疫狀態(tài),目的是清除乙肝病毒DNA (HBVDNA)緩解疾病。然而,治療費(fèi)用昂貴且有許多副作用,如貧血、血紅蛋白下降、惡心、嘔吐,出冷汗等。而且僅約1/3患者用α-干擾素治療持續(xù)應(yīng)答。此外,核苷類似物不能完全消除病毒,并可能導(dǎo)致病毒基因突變。因此,開發(fā)新的抗病毒治療藥物仍然是一個(gè)重大的科研任務(wù)。但由于缺乏合適的HBV感染細(xì)胞模型或小動(dòng)物模型來(lái)評(píng)價(jià)新的治療策略而使CHB的治療受到阻礙。 目前,HepG2.2.15細(xì)胞系是最常用的體外研究HBV的細(xì)胞模型,HepG2.2.15細(xì)胞系作為公認(rèn)的HBV全基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,能支持HBV的復(fù)制,分泌感染性病毒顆粒。但因病毒基因以較為固定的拷貝數(shù)整合于宿主細(xì)胞染色體,表達(dá)水平低,其作為體外HBV感染細(xì)胞模型,尤其是作為抗病毒藥物篩選和研究耐藥突變株生物學(xué)特征的感染模型,受到了一定的局限。目前仍然迫切需要建立一個(gè)體外細(xì)胞培養(yǎng)或試驗(yàn)動(dòng)物模型來(lái)幫助我們理解HBV感染中病毒-宿主相互作用,確定病毒突變體的致病性,檢測(cè)新的抗病毒藥物和對(duì)慢性感染治療方法的選擇。 應(yīng)用病毒基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)使細(xì)胞永生化是建立連續(xù)傳代細(xì)胞系的一種方法。將SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)是最常用的細(xì)胞永生化的方法,幾乎適用于各種人類細(xì)胞類型。通過(guò)對(duì)SV40T基因介導(dǎo)的永生化細(xì)胞系的深入研究,多數(shù)研究結(jié)果顯示SV40T基因的導(dǎo)入除提高轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)速率外,能保留其原始細(xì)胞的許多分化表型,而非原始基因的表達(dá)很少見,在細(xì)胞水平上可反映其原始細(xì)胞的生物學(xué)特性,可作為體外研究的模型。1.3拷貝HBVDNA質(zhì)粒含HBV完整復(fù)制體,基因組小于2.0拷貝,且復(fù)制和表達(dá)效率高于1.2和1.1拷貝,包含了HBV5’末端Enh Ⅰ、Enh Ⅱ,復(fù)制起始區(qū)(DR1、DR2)、前基因組轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)x和前C區(qū)啟動(dòng)子,x開放讀碼框等,所以應(yīng)用的最多。 本研究的目的是構(gòu)建SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞系,觀察1.3倍全基因HBV真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒(pHBV1.3)在其細(xì)胞中的表達(dá)。希望能建立一種新型的HBV體外細(xì)胞模型。 第一部分SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞系的建立 [目的] 建立SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞系,以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。 [方法] 1、建立SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞系。 1.1、原代小鼠肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)。 1.2、SV40T基因質(zhì)粒(pRSV-T)擴(kuò)增及抽提。 1.3、利用脂質(zhì)體lipofectamine2000介導(dǎo)pRSV-T質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞。 2、SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞系的檢測(cè)。 2.1、SV40T抗原檢測(cè)：通過(guò)間接免疫熒光法檢測(cè)SV40T抗原在小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的分布情況。 2.2、形態(tài)學(xué)觀察：在倒置相差顯微鏡下觀察原代鼠肝細(xì)胞和SV40LT抗原永生化小鼠肝細(xì)胞的形態(tài),同時(shí)在電子顯微鏡下對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。 2.3、繪制原代及SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,了解細(xì)胞生長(zhǎng)周期。 2.4、生化檢測(cè)：測(cè)定原代及SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、甲胎蛋白(AFP)的含量。 2.5、RT-PCR檢測(cè)肝細(xì)胞系中ALB-mRNA的表達(dá)。 2.6、免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞CK-18的免疫反應(yīng)性。 [結(jié)果] 1、原代小鼠肝細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染： 直接膠原酶消化法分離的肝細(xì)胞培養(yǎng)后,倒置相差顯微鏡下原代小鼠肝細(xì)胞形態(tài)扁平、呈多邊形、通常多個(gè)細(xì)胞成串簇狀排列,細(xì)胞呈單層貼壁、鋪滿瓶底。原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SV40L T抗原和50μ g/ml氨芐青霉素(Amp)篩選,于轉(zhuǎn)染后30天出現(xiàn)一明顯的上皮細(xì)胞樣抗Amp的陽(yáng)性克隆細(xì)胞。其余脂質(zhì)體組和空白對(duì)照組細(xì)胞已大多死亡。 2、SV40T抗原檢測(cè)： 轉(zhuǎn)染后SV40T抗原免疫熒光逐漸增強(qiáng),至轉(zhuǎn)染后30天時(shí)可見明顯熒光。胞漿內(nèi)呈磨砂樣熒光,細(xì)胞核內(nèi)呈顆粒狀熒光。 3、轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞形態(tài)： 原代及轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞均呈單層貼壁生長(zhǎng),形態(tài)呈上皮細(xì)胞樣,原代小鼠細(xì)胞增殖緩慢,傳代一次需7-9d。永生化小鼠肝細(xì)胞增殖明顯比原代快,傳代一次只需4-5d。在電子顯微鏡下,轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞與正常原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞相比無(wú)明顯差異,呈典型的肝細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu),細(xì)胞內(nèi)豐富的糖原顆粒和大量的線粒體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰可見；細(xì)胞膜外可見典型的微狀突起物；正在進(jìn)行分裂的雙核仁細(xì)胞體現(xiàn)了轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞體外增殖分化的過(guò)程。 4、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線： 在含10%的胎牛血清培養(yǎng)基中原代小鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,原代小鼠肝細(xì)胞在接種后第7天細(xì)胞增殖減緩。第8天開始出現(xiàn)細(xì)胞死亡。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞于接種后第3-4日起增殖減緩,第5天開始出現(xiàn)細(xì)胞死亡。 5、生化檢測(cè)： 原代及SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中ALT、AST、AFP的含量變化差異無(wú)顯著性(PO.05)。 6、RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞中ALB mRNA的表達(dá)： 對(duì)原代和轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞進(jìn)行總RNA抽提和一步法RT-PCR擴(kuò)增ALB-mRNA,結(jié)果2個(gè)標(biāo)本在475bp處均出現(xiàn)明亮條帶,表明轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞具有表達(dá)ALB mRNA的能力。 7、Wostern blot檢測(cè)原代、轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞角蛋白18(CK-18)免疫反應(yīng)性：對(duì)原代、轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)提取,經(jīng)SDS-PAGE、Western blot檢測(cè),目的條帶細(xì)胞CK-18顯色均呈陽(yáng)性,表明原代、轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞均具有CK-18免疫反應(yīng)性。 [結(jié)論] 1、pRSV-T質(zhì)�？梢允剐∈蟾渭�(xì)胞永生化,建立SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞系。 2、SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞系具有原代小鼠肝細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特性及功能,且在體外可以傳代培養(yǎng)�？梢赃M(jìn)一步用來(lái)研究建立適宜于HBV感染的細(xì)胞模型。 到目前為止,經(jīng)過(guò)了五年多的凍存復(fù)蘇和傳代培養(yǎng),SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞已經(jīng)傳代50代次,傳代、復(fù)蘇和凍存不改變細(xì)胞的形態(tài)及增殖能力,細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)特性沒(méi)有明顯改變。 第二部分pHBV1.3質(zhì)粒在SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞系的表達(dá) [目的] 觀察pHBV1.3質(zhì)粒在SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞系的表達(dá),希望能建立一種新型的HBV體外細(xì)胞模型。 [方法] 1、pHBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞系：按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒l(wèi)ipofectamine2000說(shuō)明將pHBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞系22代。 2、pHBV1.3質(zhì)粒在永生化小鼠肝細(xì)胞中的表達(dá) 2.1、HBsAg及HBeAg的檢測(cè)：用Abbott的AXSYM自動(dòng)免疫分析儀及其配套的微粒子酶免分析法(MEIA)診斷試劑盒對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液進(jìn)行HBsAg、HBeAg檢測(cè)。 2.2、間接免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBsAg、HBcAg的表達(dá)：將SV40T永生化鼠肝細(xì)胞系22代細(xì)胞接種于24孔板,轉(zhuǎn)染后24、48、72h用PBS洗滌細(xì)胞,4%多聚甲醛固定,按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),兔抗一HBc以1：500稀釋,鼠抗一HBs1：50稀釋。 2.3、Southern blot:提取轉(zhuǎn)染后72h細(xì)胞內(nèi)總DNA并純化。將純化的DNA樣本點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠上電泳后,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與地高辛標(biāo)記的3.2KB全長(zhǎng)HBVDNA探針雜交。地高辛標(biāo)記及Southern試劑盒購(gòu)于羅氏,方法按說(shuō)明進(jìn)行。 2.4、透射電鏡檢測(cè)pHBVl.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)液中HBV病毒顆粒：收集轉(zhuǎn)染后72小時(shí)培養(yǎng)上清液,280000×g,4℃超速離心5小時(shí)棄去上清,沉淀用100μ L TN緩沖液溶解混勻。滴于有支持膜(0.3%Formvar)的銅網(wǎng)上,2%磷鎢酸負(fù)染2分鐘,室溫中干燥30分鐘,JEOL透射電鏡(JEM-1200EX Electron Microscope)觀察,拍照。 [結(jié)果] 1、轉(zhuǎn)染24h后,細(xì)胞上清液中可檢出HBsAg、HBeAg,72h達(dá)到高峰,96h呈下降趨勢(shì)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代后細(xì)胞上清液中HBsAg、HBeAg呈下降趨勢(shì)。傳代至第4代時(shí)HBsAg、HBeAg均為陰性。 2、轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,有HBsAg和HBcAg陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn),72h細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)。HBsAg主要呈胞漿內(nèi)彌漫性分布,HBcAg為核漿型分布,以漿型為主。 3、Southern雜交檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HBVDNA的復(fù)制：轉(zhuǎn)染后72h,轉(zhuǎn)染細(xì)胞中存在3.5KB、2.4KB、2.1KB病毒復(fù)制中間體。 4、電鏡結(jié)果：收集轉(zhuǎn)染后72小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清,超速離心后,沉淀用2%磷鎢酸負(fù)染,JEM-1200EX透射電鏡觀察。電鏡下可以見到少量直徑42nm的雙層殼狀Dane顆粒和較多的直徑22nm的小球型顆粒及少量絲狀顆粒。 [結(jié)論] 經(jīng)SV40T抗原轉(zhuǎn)染的小鼠肝細(xì)胞系可以被pHBV1.3質(zhì)粒二次轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后HBV可以在SV40T抗原轉(zhuǎn)染的永生化小鼠肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行病毒基因的復(fù)制,形成病毒復(fù)制中間體。并且進(jìn)一步進(jìn)行病毒基因的表達(dá),合成HBV特異性蛋白HBsAg、 HBeAg和HBcAg; pHBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后永生化小鼠肝細(xì)胞能合成子代病毒顆粒并分泌出細(xì)胞。 總結(jié) 本研究結(jié)果證實(shí),pRSV-T質(zhì)�？梢允剐∈蟾渭�(xì)胞永生化,建立SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞系。SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞系具有原代小鼠肝細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)特性,且在體外可以傳代培養(yǎng)。且可以被pHBVl.3質(zhì)粒二次轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后乙型肝炎病毒可以在SV40T抗原轉(zhuǎn)染的永生化小鼠肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行病毒基因的復(fù)制,形成ssDNA、dsDNA和rcDNA病毒復(fù)制中間體,且進(jìn)一步進(jìn)行病毒基因的表達(dá),合成HBV特異性蛋白HBsAg、HBeAg和HBcAg；pHBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后永生化小鼠肝細(xì)胞能合成子代病毒顆粒并分泌出細(xì)胞。SV40T永生化小鼠肝細(xì)胞可以作為一個(gè)新型的適宜于HBV瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞模型,為體外抗病毒藥物篩選提供新的細(xì)胞模型。觀察了HBVDNA在小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況,為建立人HBVDNA轉(zhuǎn)染跨種屬肝細(xì)胞模型奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2718886