【摘要】：第一章:異甘草素對實(shí)驗(yàn)小鼠慢性胰腺炎的保護(hù)作用【目的】通過建立慢性胰腺炎小鼠模型,觀察異甘草素(ILG)對小鼠胰腺組織的影響�！痉椒ā繉⑿∈箅S機(jī)分為對照組、造模組和治療組,采用反復(fù)腹腔注射雨蛙素的方法構(gòu)建小鼠慢性胰腺炎模型,在造模后半程給予小鼠ILG灌胃治療。每周一次體重測量并觀察小鼠體重及胰重/體重的變化。通過組織切片HE染色及天狼星紅染色判斷造模是否成功。利用PCR檢測小鼠胰腺組織中纖維化相關(guān)因子(FN、α-SMA、COL-1)及炎癥相關(guān)因子(CCL2、CD68、F4/80、TNF-α和IL-6)的mRNA水平表達(dá)情況。觀察ILG對小鼠肝臟功能及其他臟器(肝臟、肺臟、腎臟和心臟)組織學(xué)影響�！窘Y(jié)果】造模組小鼠平均體重較對照組顯著降低(21.4±0.81g vs 24.2±0.66g,p0.01);治療組小鼠平均體重較造模組顯著升高(22.9±0.42g vs 21.4±0.81g,p0.01)。胰腺重量/體重方面,造模組較對照組降低(1.73±0.29 vs 4.87±0.55,p0.01),而治療組較造模組顯著上升(3.37±0.53 vs 1.73±0.29,p0.01)。胰腺HE染色及天狼星紅染色均顯示造模成功,造模組小鼠胰腺腺泡細(xì)胞大量減少并伴有“管狀復(fù)合物”形成,間質(zhì)中可見膠原纖維沉積及炎細(xì)胞浸潤。治療組則有顯著改善和恢復(fù),腺泡萎縮、膠原沉積及炎細(xì)胞浸潤均不同程度減輕。造模組升高表達(dá)的纖維化標(biāo)志物(α-SMA、FN、COL-1)及相關(guān)炎癥因子(CCL2、CD68、F4/80、TNF-α和IL-6)均在治療組中不同程度降低。此外,ILG未引起血糖(Glu)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽固醇(T-CHO)及甘油三酯(TG)血清學(xué)水平以及肝、肺、腎、心組織學(xué)水平改變�！窘Y(jié)論】(1)ILG灌胃治療可顯著升高CP模型小鼠的體重及胰腺重量/體重;(2)ILG灌胃治療可顯著改善CP模型小鼠胰腺組織的病理改變,同時抑制纖維化相關(guān)因子及炎癥相關(guān)因子的表達(dá);(3)ILG灌胃治療不引起Glu、ALT、T-CHO及TG的血清學(xué)水平改變,同時在肝、肺、腎、心的組織學(xué)水平也不產(chǎn)生影響。第二章:異甘草素抑制胰腺星狀細(xì)胞活化的分子機(jī)制研究【目的】探討異甘草素(ILG)對PSCs活化的影響及其潛在的作用靶點(diǎn)和機(jī)制【方法】采用CCK8法檢測ILG對PSCs的細(xì)胞存活率影響并獲得適宜的濃度范圍。將ILG單獨(dú)作用于靜息狀態(tài)或加用TGF-β刺激后的人PSCs,以等體積的DMSO作為對照,運(yùn)用PCR、Western blot及免疫熒光技術(shù)檢測PSCs活化指標(biāo)FN、α-SMA、COL-1及CTGF的表達(dá)水平。通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞技術(shù),觀察ILG對PSCs遷移及凋亡的影響。通過轉(zhuǎn)錄組基因測序技術(shù)尋找ILG作用于PSCs的潛在靶基因和信號通路并加以驗(yàn)證�！窘Y(jié)果】CCK8結(jié)果顯示ILG作用于PSCs的適宜濃度范圍為0~20μM。PCR、Western blot及細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,ILG處理后可抑制PSCs內(nèi)FN、α-SMA、COL-1及CTGF的升高。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示ILG作用后,PSCs遷移距離減少,劃痕相對寬度分別為5μM:1.04±0.17(p0.05);10μM:2.31±0.18(p0.01);20μM:3.70±0.23(p0.01)。Transwell實(shí)驗(yàn)也顯示ILG作用后,穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)目顯著下降(5μM 72±13%,p0.05;10μM 41±6%,p0.01;20μM 14±3%,p0.01)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),ILG可促進(jìn)PSCs的凋亡。轉(zhuǎn)錄組基因測序發(fā)現(xiàn),ILG作用PSCs后IL-1β、CCL2、PDGFB表達(dá)降低的同時DUSP5表達(dá)升高。通過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),ILG可顯著降低PSCs內(nèi)MAPK通路中ERK1/2和JNK1/2的磷酸化水平并抑制下游c-Jun的核轉(zhuǎn)位。同時,ILG還降低了PSCs的PDGFR磷酸化水平并升高了DUSP5、DUSP10的表達(dá)�！窘Y(jié)論】(1)ILG抑制PSCs活化、遷移,促進(jìn)其凋亡;(2)ILG抑制PSCs內(nèi)IL-1β,CCL2,PDGFB表達(dá)的同時促進(jìn)DUSP5的表達(dá);(3)ILG通過降低PDGFR的磷酸化水平及升高DUSP5、DUSP10的表達(dá)來抑制MAPKs通路中JNK1/2和ERK1/2的磷酸化,最終導(dǎo)致PSCs的活化被抑制。第三章:異甘草素調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制研究【目的】探討異甘草素(ILG)對巨噬細(xì)胞極化的影響及其在PSCs與巨噬細(xì)胞通訊中的作用�！痉椒ā繉LG作用于RAW264.7后,采用CCK8法檢測其對細(xì)胞存活率的影響并獲得適宜濃度范圍。選取該濃度范圍內(nèi)的ILG預(yù)處理RAW264.7,用LPS和IL-4分別誘導(dǎo)RAW264.極化,采用PCR和Western blot檢測不同誘導(dǎo)方式下,RAW264.7的極化類型及其相關(guān)分子標(biāo)志物的變化。利用LPS短時刺激RAW264.7后觀察ILG的作用通路變化。最后用PCR檢測ILG對PSCs內(nèi)炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響,利用PSCs的上清液刺激RAW264.7,觀察其極化改變情況及ILG的作用�！窘Y(jié)果】CCK8結(jié)果顯示ILG作用于RAW264.7的適宜濃度范圍為0~20μM。PCR和Western blot顯示,ILG可抑制LPS誘導(dǎo)后RAW264.7內(nèi)CD86、IL1-β、TNF-α、iNOS和IL-6的表達(dá),而對經(jīng)IL-4誘導(dǎo)后,RAW264.7內(nèi)升高表達(dá)的Arg-1、CD206、CD301和TGF-β無顯著影響。短時LPS刺激后,Western blot檢測顯示RAW264.7內(nèi)IκBα蛋白水平降低的同時p65和IκBα的磷酸化水平升高,ILG預(yù)處理后,IκBα蛋白水平升高的同時p65和IκBα的磷酸化水平也呈濃度梯度降低。PCR檢測顯示ILG作用于PSCs后,CCL2、CXCL1、CCL5、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA相對表達(dá)水平降低。將PSCs的細(xì)胞上清液處理RAW264.7,通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)RAW264.7內(nèi)IL-1β和CD86的表達(dá)升高,而TGF-β和Arg-1不受影響,ILG預(yù)處理后RAW264.7內(nèi)IL-1β和CD86的表達(dá)水平也呈梯度降低,而TGF-β和Arg-1表達(dá)也同樣不受影響�！窘Y(jié)論】(1)ILG抑制巨噬細(xì)胞M1型極化,對M2型極化無顯著影響;(2)ILG對NF-κB通路的抑制作用參與巨噬細(xì)胞M1型極化的調(diào)控;(3)ILG抑制PSCs內(nèi)炎癥因子及趨化因子的表達(dá),在PSCs上清作用巨噬細(xì)胞后的M1型極化中發(fā)揮抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R576
【圖文】：

理學(xué)改變包括進(jìn)行性纖維化和持續(xù)性的炎癥，而其發(fā)究 CP 的病理生理機(jī)制，越來越多的動物模型也隨即素（CCK）類似物，可誘導(dǎo)胰腺合成并大量分泌蛋白酶組織的炎癥和損傷并逐步發(fā)生胰腺纖維化[7]。反復(fù)雨蛙越來越被廣泛運(yùn)用到多項(xiàng)研究中[34, 35]。因此，我們采。藥甘草（Glycyrrhiza）的根莖中提取出的一種黃酮類化合在抗炎、抗氧化、抗癌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等諸多方示，ILG 在 AP 動物模型中有保護(hù)作用[33]，而目前尚無道。因此，本章旨在通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察 ILG 在 CP 動其他臟器存在影響。

圖 1-2 小鼠造模方式及流程圖素所需計量的計算：每周小鼠稱重 1 次并記錄，根據(jù)體重，ILG 40mg/kg，計算所需的各試劑的溶液體積。停止注射雨蛙素和灌胃，放置于新的飼養(yǎng)籠中正常進(jìn)食飲況。標(biāo)本取材和處理前，小鼠正常進(jìn)食飲水 1 周，采用水合氯醛腹腔注射麻醉后采用斷頸法處死小鼠。血液標(biāo)本靜置 30min 后，4℃，取上層血清，分裝后放置-80℃ 冰箱保存。在動物解剖臺找到胰腺，隨后沿著胰腺體尾部向胰頭部位進(jìn)行分離。將分，第一部分（約 0.5g）放入裝有 RNA later 的離心管中下部分浸入 4%多聚甲醛溶液中，于搖床上固定 24h 后更換放入 4℃冰箱中固定過夜，用于后續(xù)制作石蠟切片、HE

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本文編號：2718856