【摘要】：目的：①探討原位PBS灌注、膠原酶離體消化、梯度離心、選擇性貼壁四步法分離Kupffer細(xì)胞（KCs）的效果。②證實(shí)NLRP3炎癥小體在游離脂肪酸（FFA）激活KCs炎癥反應(yīng)中的作用。③闡述NLRP3在LPS激活KCs炎癥反應(yīng)中的可能作用。④初步明確FFA促進(jìn)LPS激活KCs炎癥反應(yīng)，探討FFA通過激活NLRP3調(diào)節(jié)IL-1表達(dá)的途徑增加LPS激活KCs炎癥反應(yīng)作用的可能機(jī)制。 方法：①采用原位PBS灌注+膠原酶離體消化+梯度離心+選擇性貼壁四步法分離KCs，根據(jù)具體步驟方法不同隨機(jī)分為3組：無膠原酶原位灌注+PBS梯度離心組（改良A組）、無膠原酶原位灌注+Percoll細(xì)胞分離液密度梯度離心方法組（B組）、膠原酶原位灌注+Percoll細(xì)胞分離液密度梯度離心方法組（C組）。動態(tài)觀察KCs的生存時間及形態(tài)變化，應(yīng)用F4/80(BM8)標(biāo)記KCs特異抗原，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色及免疫熒光檢測鑒定KCs及判斷純度；吞墨試驗了解KCs的吞噬功能，應(yīng)用臺盼藍(lán)拒染試驗判斷細(xì)胞的活性，比較不同組別分離方法的KCs得率、活性及純度。②首先分離小鼠KCs觀察不同濃度的FFA對KCs炎癥反應(yīng)影響； KCs隨機(jī)分為5組：Control組，加培養(yǎng)基、0.2mmol/L組、0.3mmol/L組、0.4mmol/L組、0.5mmol/L組；FFA刺激24h后， Western blot檢測NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白表達(dá)，實(shí)時熒光定量PCR（real time qPCR）檢測NLRP3、Caspase-1、ASC的mRNA表達(dá)， ELISA檢測KCs培養(yǎng)上清液IL-1、IL-18的表達(dá)情況。其次了解在固定FFA濃度（0.35mmol/L）對KCs的炎癥反應(yīng)的時間-效應(yīng)關(guān)系，KCs隨機(jī)分5組，對照組加入培養(yǎng)基及相應(yīng)量的BSA、4h組、8h組、12h組、24h組，分別給予0.35mmol/L的FFA刺激，檢測KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及基因表達(dá)以及IL-1、IL-18的變化情況。最后KCs隨機(jī)分為4組：Control組加培養(yǎng)基及相應(yīng)量的BSA、FFA組、FFA+NLRP3siRNA組、FFA+Control shRNA組；shRNA轉(zhuǎn)染KCs后8h通過熒光顯微鏡鑒定轉(zhuǎn)染效果。FFA刺激24h后，檢測KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及其基因表達(dá)和IL-1、IL-18的變化情況，分析NLRP3在FFA致KCs炎癥反應(yīng)中的作用。③首先探討LPS致KCs炎癥反應(yīng)的量效關(guān)系，分離的KCs隨機(jī)分為4組：Control組、LPS組（0.5ug/ml）、LPS（1ug/ml）組、LPS（2ug/ml）組，LPS刺激24h后，檢測KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及其基因表達(dá)及IL-1、IL-18的表達(dá)情況。其次分離小鼠KCs隨機(jī)分為4組：Control組、LPS組（1ug/ml）、LPS（1ug/ml）+shRNA組、LPS（1ug/ml）+Control siRNA組，LPS刺激24h，檢測KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及其基因表達(dá)以及IL-1、IL-18的變化情況，分析NLRP3在LPS激活KCs炎癥反應(yīng)中的作用。(4)分離小鼠KCs隨機(jī)分為6組：Control組、FFA組、LPS組、FFA+LPS組、FFA+LPS+shRNA組、FFA+LPS+Control shRNA組；檢測KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及其基因表達(dá)以及IL-1、IL-18的表達(dá)情況，分析FFA對LPS激活KCs炎癥反應(yīng)的影響。 結(jié)果：①剛分離的KCs細(xì)胞近似類圓形，接種1h后，此時收獲細(xì)胞純度較高，但由于貼壁時間短，部分KCs未貼壁使細(xì)胞得率相對較低，KCs貼壁培養(yǎng)2h后細(xì)胞的得率及純度相對較高。觀察KCs形態(tài)見在熒光顯微鏡下328nm熒光未能激發(fā)KCs發(fā)出熒光，培養(yǎng)2天后，細(xì)胞充分伸展，表現(xiàn)形狀多樣性，可呈現(xiàn)星形或不規(guī)則形，培養(yǎng)KCs最長見存活4周。F4/80免疫細(xì)胞化學(xué)染色及免疫熒光行激光共聚焦顯示分離的細(xì)胞為KCs；吞墨試驗表現(xiàn)為KCs吞噬大量碳素顆粒，臺盼藍(lán)染色表現(xiàn)為正常KCs拒染，凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為被染成藍(lán)色，計數(shù)各組KCs的活性數(shù)目均在90%左右。綜合得率、純度及活性判斷改良法原位PBS灌注+膠原酶離體消化+梯度離心+選擇性貼壁四步法分離KCs與其它兩組無明顯差異（P＞0.05），是一種簡便有效分離KCs的方法。②NLRP3shRNA質(zhì)粒能夠高效轉(zhuǎn)染KCs，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后8小時KCs轉(zhuǎn)染效果可以達(dá)到85%。FFA刺激KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC表達(dá)明顯升高，培養(yǎng)液的IL-1、IL-18表達(dá)水平明顯升高（P＜0.001），同條件干預(yù)組內(nèi)NLRP3、Caspase-1、ASC的表達(dá)趨勢無明顯差異（P＞0.05）。NLRP3基因沉默可以有效地抑制NLRP3、Caspase-1、ASC及IL-1、IL-18的表達(dá)（P＜0.001）。③LPS刺激后，KCs的IL-1、IL-18表達(dá)水平明顯升高，但是NLRP3、Caspase-1、ASC的表達(dá)改變不明顯（P＞0.05），NLRP3基因沉默，無明顯抑制LPS激活KCs的IL-1、IL-18升高（P＞0.05）。④FFA明顯增加了KCs對LPS的敏感性，促進(jìn)LPS致的致KCs炎癥反應(yīng)，KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC以及IL-1、IL-18表達(dá)明顯升高，致炎作用明顯高于單獨(dú)FFA或者LPS的作用（P＜0.001），NLRP3基因沉默可以有效地抑制NLRP3、Caspase-1、ASC的表達(dá)，細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1、IL-18的含量水平明顯降低（P＜0.001）。 結(jié)論：①原位PBS灌注+離體膠原酶消化+梯度離心+選擇性貼壁四步法分離法簡化了KCs的提取分離，是一種有效、簡便、經(jīng)濟(jì)的分離KCs的方法。②高濃度的FFA對KCs存在明顯脂毒性，NLRP3炎癥小體介導(dǎo)了FFA誘導(dǎo)的KCs的炎癥反應(yīng)，F(xiàn)FA通過激活KCs的NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)促進(jìn)分泌IL-1、IL-18炎癥因子，而激發(fā)KCs在NASH中的炎癥反應(yīng)，阻斷NLRP3信號通路可能是拮抗FFA促進(jìn)NASH的新途徑。③LPS能夠明顯激活KCs產(chǎn)生炎癥反應(yīng)分泌IL-1、IL-18，但是LPS致KCs炎癥反應(yīng)并不依賴于NLRP3通路。④FFA能夠明顯促進(jìn)LPS激活KCs炎癥反應(yīng)，當(dāng)shRNA抑制NLRP3后FFA促進(jìn)LPS致KCs的炎癥反應(yīng)作用明顯減弱，提示FFA可能依賴于NLRP3激活I(lǐng)L-1的途徑促進(jìn)LPS致KCs炎癥反應(yīng)，從而放大FFA脂毒性基礎(chǔ)上的LPS激活KCs炎癥反應(yīng)作用，參與NASH的炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R575.5
【圖文】：

圖 2-1：載體圖譜，目的基因片段導(dǎo)入載體示意圖Fig. 2-1 profiles of pcDNA6.2 -GW/ EmGFP-miR 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 100μl 感受態(tài)細(xì)胞 DH5α，涂 LB 平板（含 50μ37℃孵育。驗證化平板分別挑取 3 個克隆，搖菌抽提質(zhì)粒后進(jìn)行測序（Invitro證重組克隆中插入片段序列是與設(shè)計的寡聚單鏈 NLRP3 DN 19-附圖 22）。 NLRP3-shRNA 序列有效性的鑒定細(xì)胞 1 天按照上述改良方法提取 KCs 并用用含 10％胎牛血清

圖 2-2：不同干預(yù)組 RT-qPCR 的擴(kuò)增曲線圖Fig. 2-2 The amplification curves of different groups

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2718739