【摘要】： 目的：肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是各種慢性肝損傷向肝硬化發(fā)展的中間階段,其發(fā)生與發(fā)展受多種因素調(diào)控,但其中心環(huán)節(jié)是各種刺激因子誘導(dǎo)肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)的活化及增殖,并產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM),沉積于肝組織中,進一步發(fā)展即形成肝硬化。因此,抑制HSCs的活化與增殖、誘導(dǎo)其凋亡是阻止肝纖維化發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵。S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-mehionine, SAM)是由蛋氨酸與三磷酸腺苷在腺苷蛋氨酸合成酶作用下催化合成的一種天然化合物,廣泛存在于人體各種組織和體液中,參與體內(nèi)多種生化反應(yīng),是生物甲基化反應(yīng)的必需中間體,直接為甲基受體提供甲基。另外,SAM還可通過轉(zhuǎn)硫作用在體內(nèi)合成一種重要的還原物質(zhì),即谷胱甘肽(glutathione, GSH),對抗氧自由基及炎性物質(zhì)對細胞的損傷。目前,外源性的SAM在臨床上主要被用于治療各種病因引起的肝內(nèi)膽汁淤積,其機制與SAM提供甲基和轉(zhuǎn)硫基作用相關(guān)。低甲基化狀態(tài)與酒精性肝病引起的肝纖維化有密切的關(guān)系,SAM作為生物甲基化的必需中間體,在理論上有可能影響肝纖維化的過程。本研究旨在觀察SAM對乙醛(acetaldehyde, AA)刺激的體外培養(yǎng)的大鼠HSCs增殖、形態(tài)變化以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達的影響,為SAM在臨床上用于預(yù)防和治療肝纖維化提供理論依據(jù)。方法：體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞株(HSC-T6),將細胞分為空白對照組、乙醛對照組(200μmol/L)、0.15mmol/L SAM組(0.15 mmol/L SAM+200μmol/L AA)、0.5 mmol/LSAM組(0.5 mmol/L SAM+200μmol/L AA)、1.5 mmol/L SAM組(1.5mmol/L SAM+200μmol/L AA)、5.0 mmol/L SAM組(5.0 mmol/L SAM+200μmol/L AA)、15.0 mmol/L SAM組(15.0 mmol/L SAM+ 200μmol/LAA), SAM干預(yù)培養(yǎng)1h后再加入乙醛,培養(yǎng)24h后采用光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化,MTT法檢測細胞增殖。依據(jù)實驗結(jié)果,選擇其中的兩個劑量用于后續(xù)實驗。將細胞分為空白對照組、乙醛對照組(200μmol/L)、1.5 mmol/L SAM組(1.5 mmol/L SAM+200μmol/L AA)、5.0 mmol/L SAM組(5.0 mmol/L SAM+200μmol/L AA), SAM干預(yù)培養(yǎng)1h后再加入乙醛,培養(yǎng)24h后采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)和Western-blot檢測細胞Ⅰ型及Ⅲ型膠原的表達。結(jié)果：1.倒置顯微鏡下見空白對照組HSC-T6細胞生長良好,呈梭形或星形。與對照組比較,乙醛對照組細胞數(shù)目增多,排列密集,細胞間間隙更小,細胞周邊偽足更多更長,胞體呈星形或不規(guī)則形。與乙醛對照組比較,SAM干預(yù)培養(yǎng)的各組細胞數(shù)目減少,細胞間的間隙增大,細胞周邊偽足減少,細胞呈短梭型或扁平形,并隨著SAM濃度的升高,此變化更加明顯。2.MTT法檢測結(jié)果顯示,空白對照組、乙醛對照組、0.15 mmol/L SAM組、0.5 mmol/L SAM組、1.5 mmol/L SAM組、5.0mmol/L SAM組、15.0 mmol/L SAM組的吸光度值(OD值)分別為(x±s)：0.463±0.0038、0.698±0.014、0.445±0.026、0.415±0.029、0.391±0.012、0.342±0.024、0.223±0.025。與空白對照組比較,乙醛對照組OD值明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與乙醛對照組比較,SAM干預(yù)的各組OD值均明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。3.RT-PCR結(jié)果顯示,空白對照組、乙醛對照組、1.5 mmol/LSAM組、5.0 mmol/L SAM組Ⅰ型膠原mRNA的相對表達量分別為(x±s)：1.416±0.020、1.972±0.038、1.681±0.031、1.461±0.032；Ⅲ型膠原mRNA的相對表達量分別為(x±s)：0.996±0.008、1.875±0.028、1.537±0.056、1.053±0.062。與空白對照組比較,乙醛對照組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA表達明顯增強,差別有統(tǒng)計學意義(P0.01)。與乙醛對照組比較,1.5 mmol/L SAM干預(yù)組及5.0mmol/L SAM干預(yù)組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA表達均明顯減弱,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。4. Western-blot結(jié)果顯示,空白對照組、乙醛對照組、1.5 mmol/L組、5.0 mmol/L組Ⅰ型膠原的相對表達量分別為(x±s)：1.109±0.070、1.298±0.101、0.970±0.058、0.829±0.030；Ⅲ型膠原的相對表達量分別為(x±s)：1.017±0.013、1.204±0.024、1.089±0.015、1.048±0.019。與空白對照組比較,乙醛對照組Ⅰ型膠原蛋白表達明顯增強,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)；Ⅲ型膠原蛋白表達顯著增強,差別有統(tǒng)計學意義(P0.01)與乙醛對照組比較,1.5mmol/L SAM干預(yù)組及5.0 mmol/L SAM干預(yù)組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白的表達均明顯減弱,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。結(jié)論：SAM在體外能有效抑制乙醛刺激的HSCs的增殖及Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成,且抑制效果與SAM濃度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。本研究證實,SAM具有抗肝纖維作用,有可能用于預(yù)防和治療酒精性肝病所導(dǎo)致的肝纖維化。
【學位授予單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R575.2
【圖文】：

醛對照組比較，SAM干預(yù)培養(yǎng)的各組細胞數(shù)目減少，細胞間的間隙增大，周邊偽足減少，細胞呈短梭型或扁平形，并隨著SAM濃度的升高，此變化更加明顯。(見圖2、3、4、5、6)。圖2空白對照組HSC一T6細胞的生長狀態(tài) FigZGrowthofHSC一 T6eellsinstate ofeontrolgrouP圖3乙醛對照組HSC一T6細胞的生長狀態(tài) Fig3GrowthofHSC一 T6eellsinstateof aeetaldehyde(AA)eontr01grouP

結(jié)果1倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化倒置顯微鏡下見空白對照組HSC一T6細胞生長良好，呈梭形或星形。與空白對照組比較，乙醛對照組細胞數(shù)目增多，排列密集，細胞間間隙更小，細胞周邊偽足更多更長，胞體呈星形或不規(guī)則形。與乙醛對照組比較，SAM干預(yù)培養(yǎng)的各組細胞數(shù)目減少，細胞間的間隙增大，周邊偽足減少，細胞呈短梭型或扁平形，并隨著SAM濃度的升高，此變化更加明顯。(見圖2、3、4、5、6)。

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本文編號：2718464