【摘要】：激活的胰腺星狀細(xì)胞(PSC)在胰腺纖維化發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在正常胰腺中PSC呈靜止?fàn)顟B(tài)胞漿中含有維生素A顆粒。當(dāng)暴露于刺激信號(hào)PSC由靜止轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)胞漿中維生素A消失,表達(dá)細(xì)胞骨架蛋白:α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA),波形蛋白,結(jié)蛋白及膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)。激活的PSC可產(chǎn)生致纖維化細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)和促分裂細(xì)胞因子血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF),合成和分泌包括I型膠原(Col1)在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs,如MMP-1,MMP-2等)及其抑制物(TIMPs)。TGF-β1經(jīng)旁分泌和自分泌調(diào)節(jié)PSC自身激活過(guò)程,增加α-SMA和Col1表達(dá),下調(diào)MMP-9合成。白細(xì)胞介素6(IL-6)是一種重要的致炎癥因子,可促進(jìn)PSC激活。全反式維甲酸(ATRA)是具有活性的維生素A代謝物,可誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物PSC向靜止型轉(zhuǎn)化,減少ECM合成,抑制乙醇誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)。PSC在胰腺纖維化形成和ECM逆轉(zhuǎn)均發(fā)揮關(guān)鍵作用,原代人PSC由于胰腺組織塊來(lái)源缺乏和細(xì)胞老化難以長(zhǎng)期培養(yǎng),有限的細(xì)胞數(shù)量不能滿足其機(jī)能研究。曾有人建立人胰腺PSC系,由于生長(zhǎng)速度的缺陷不能確切展示原代PSC的表型特征,難以被廣泛使用。本研究采用RSV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)SV40大抗原在人原代激活PSC表達(dá)建立了永生化人PSC系(HP-1細(xì)胞)。進(jìn)而通過(guò)對(duì)HP-1細(xì)胞和PSC生物學(xué)性狀和蛋白組學(xué)分析,評(píng)價(jià)HP-1細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)水平研究PSC介導(dǎo)人類胰腺纖維化的可能性。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)建立ALC誘導(dǎo)HP-1細(xì)胞體外模型,明確ATRA抑制ALC作用下HP-1細(xì)胞介導(dǎo)纖維化的作用特征,并嘗試從ATRA抑制TGF-β1信號(hào)通路闡明其抗纖維化機(jī)制。本論文分為兩個(gè)部分:第一部分:人胰腺星狀細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)性狀和蛋白組學(xué)分析研究目的:本研究旨在采用RSV啟動(dòng)子/加強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)SV40 T抗原表達(dá)建立永生化人PSC系(HP-1細(xì)胞)。通過(guò)測(cè)定HP-1細(xì)胞和原代激活PSC基質(zhì)蛋白和基質(zhì)重構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白對(duì)刺激因子反應(yīng)性和蛋白質(zhì)表達(dá)譜,評(píng)價(jià)HP-1細(xì)胞在研究PSC介導(dǎo)胰腺纖維化發(fā)生學(xué)作為可利用工具的可能性。研究方法:采用膠原酶P灌注消化法分離人胰腺良性占位病變周邊正常胰腺組織的PSC,10%FBS DMEM培養(yǎng),4次傳代的激活PSC用于本研究。采用RSV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)SV40 T抗原在人原代激活PSC表達(dá)建立永生化人PSC系HP-1細(xì)胞。采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)HP-1細(xì)胞SV 40 T抗原和GFAP表達(dá),免疫熒光法測(cè)定波形蛋白,結(jié)蛋白和α-SMA表達(dá);采用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-q PCR)測(cè)定HP-1細(xì)胞和PSC的α-SMA、CTGF、Col1A1、MMP-1、MMP-2和TIMP-2 m RNA水平;采用Western Blot測(cè)定上述基質(zhì)蛋白和基質(zhì)重構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白與細(xì)胞受體TGFβR2、Bambi、PDGFRβ和PPRPγ蛋白含量。采用脂質(zhì)體Fu GENE 6和X-Treme GENE Si RNA分別對(duì)HP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒p EGFP-N1。分離HP-1細(xì)胞和PSC的裂解蛋白質(zhì),胰酶消化,串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tag,TMT)標(biāo)記,用EASY-n LC 1000超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離,提交高效質(zhì)譜Q Exactive TM Plus組合型四極桿Orbitrap TM質(zhì)譜儀(MS/MS)進(jìn)行檢測(cè)和分析。本研究以1.5倍數(shù)變化為差異表達(dá)閾值,t-檢驗(yàn)p0.05為顯著性差異,進(jìn)而確定兩種細(xì)胞間的顯著差異蛋白質(zhì)。研究結(jié)果:本研究建立了永生化HP-1細(xì)胞,該細(xì)胞核中表達(dá)SV40 T抗原,胞漿中表達(dá)GFAP、波形蛋白、結(jié)蛋白和α-SMA特征性細(xì)胞骨架蛋白與TGFβR2、Bambi、PDGFRβ和PPRPγ受體。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HP-1細(xì)胞和PSC在TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA、CTGF、Col1A1和TIMP-2 m RNA與蛋白合成增加以及MMP-1/2 m RNA和蛋白合成減少方面表現(xiàn)一致。HP-1細(xì)胞脂質(zhì)體Fu GNE 6和X-Treme GENE Si RNA轉(zhuǎn)染效率分別達(dá)61.8%和88.65%。HP-1細(xì)胞和PSC比較蛋白組學(xué)研究顯示:兩種細(xì)胞可定量的共享蛋白質(zhì)是4537種,未發(fā)現(xiàn)單一細(xì)胞僅有的蛋白質(zhì)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示54種蛋白質(zhì)在HP-1細(xì)胞中上調(diào),45種蛋白質(zhì)在PSC中上調(diào),其余4438種蛋白質(zhì)的表達(dá)(占兩種細(xì)胞可定量總蛋白質(zhì)的97.8%)在這兩種細(xì)胞之間沒(méi)有顯著差異。差異蛋白若以±2.0倍數(shù)變化的絕對(duì)值為界不含有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,纖維源性細(xì)胞因子,細(xì)胞生長(zhǎng)因子及基質(zhì)重構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白。結(jié)論:HP-1細(xì)胞具有激活PSC的特征性標(biāo)志,對(duì)纖維源性細(xì)胞因子刺激反應(yīng)性和蛋白質(zhì)表達(dá)譜與PSC基本一致,其可成為有效的工具用于PSC介導(dǎo)胰腺纖維化發(fā)生學(xué)的研究。第二部分:維甲酸抑制PSC介導(dǎo)胰腺纖維化作用的實(shí)驗(yàn)研究研究目的:本研究旨在明確ATRA抑制酒精(ALC)作用下人PSC介導(dǎo)胰腺纖維化的作用特征,評(píng)價(jià)ATRA抑制TGF-β1信號(hào)通路在抗胰腺纖維化的作用。研究方法:我們采用RSV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)SV40 T抗原在人原代激活PSC表達(dá)建立了永生化人PSC系HP-1細(xì)胞。本研究采用HP-1細(xì)胞建立了低血清培養(yǎng)模型。采用Bodipy熒光染色法檢測(cè)HP-1細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)顆粒,Western blot檢測(cè)HP-1細(xì)胞Smad2、p Smad2、Smad3和p Smad3的表達(dá)。采用RT-q PCR檢測(cè)HP-1細(xì)胞Col1A1、α-SMA、IL-6、TGF-β1和MMP-9m RNA轉(zhuǎn)錄水平,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定Col1A1、α-SMA、IL-6、TGF-β1和MMP-9蛋白含量。研究結(jié)果:本研究發(fā)現(xiàn)ATRA(5μM)可明顯促進(jìn)低血清培養(yǎng)(0.5%FBS DMEM)和ALC(50 m M)誘導(dǎo)的HP-1細(xì)胞中脂質(zhì)顆粒形成,誘導(dǎo)細(xì)胞向靜止轉(zhuǎn)化。ALC處理的HP-1細(xì)胞IL-6和TGF-β1 m RNA合成和蛋白質(zhì)分泌水平均較對(duì)照組明顯升高(4組間p均0.001)。采用ALC和IL-6(100 ng/ml)分別處理HP-1細(xì)胞,TGF-β1合成水平均提高,24 h達(dá)到最高值,而ALC處理的HP-1細(xì)胞合成Col1A1和α-SMA 48 h后水平較高。進(jìn)一步采用ATRA與ALC同時(shí)處理HP-1細(xì)胞結(jié)果發(fā)現(xiàn):ATRA不僅使ALC誘導(dǎo)24 h出現(xiàn)的TGF-β1峰值明顯下降,也可使48 h出現(xiàn)的Col1A1和α-SMA升高水平明顯下降。為明確ATRA是否可抑制TGF-β1誘導(dǎo)Smad2/3磷酸化,采用外源性TGF-β1(5 ng/ml)預(yù)處理HP-1細(xì)胞45 min后加入ATRA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATRA可明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Smad2/3磷酸化(兩者P0.001),明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Col1A1和α-SMA m RNA和蛋白質(zhì)合成(4組間P0.001),明顯增加MMP-9 m RNA和蛋白質(zhì)合成(兩者P0.001)。結(jié)論:ATRA可促進(jìn)人PSC向靜止轉(zhuǎn)化,通過(guò)下調(diào)TGF-β1/Smad2/3信號(hào)通路,抑制PSC介導(dǎo)的膠原合成和促進(jìn)其降解。本研究進(jìn)一步為ATRA防治胰腺纖維化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R576
【圖文】：

圖 2.1 永生化人 PSC 系 HP-1 細(xì)胞的關(guān)鍵特征Fig 2.1 Key characteristics of immortalized human PSC cell line HP-1 cell.Phase contrast microscopy in HP-1 cells after seeding 12 h (A); HP-1 cells were detected byimmunocytochemistry to show the presence of SV40 T antigen (B) or GFAP (C), and byimmunofluorescence to show the presence of vimentin (D), desmin (E),or α-SMA (F(Original magnification ×200 in (A); ×400 in B-F).2.3.2 PSC 和 HP-1 細(xì)胞受體的表達(dá)Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示：HP-1 細(xì)胞與原代激活 PSC 一樣可表達(dá)多種標(biāo)志性受體包括 TGFβR2、Bambi、PDGFRβ和 PPARγ（Fig 2.2）。

圖 2.2 PSC 和 HP-1 細(xì)胞表達(dá)受體ig 2.2 Expression of receptors in PSCs and HP-1 ceowing similar expression of various receptors in PSCs and H及基質(zhì)重構(gòu)蛋白的表達(dá)和調(diào)節(jié) 是激活 PSC 的骨架蛋白之一，CTGF 是一種基質(zhì) PSC 合成 Col1 的中間介導(dǎo)者[68]。本研究 RT-qPC的 PSC 和 HP-1 細(xì)胞α-SMA，CTGF 和 Col1A1 m明顯升高（P<0.001），PDGF 對(duì) PSC 和 HP-1 細(xì)胞αRNA 表達(dá)量無(wú)影響（Fig 2.3A-C）。Western blot

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1 鄭振江;向光明;劉續(xù)寶;;胰腺星狀細(xì)胞在胰腺纖維化中的作用[J];中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志;2010年08期

2 李Z諢

本文編號(hào)：2716777