【摘要】：背景和目的:染色質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的病毒微染色體由組蛋白、非組蛋白和乙型肝炎病毒（HBV）共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）一起共同組裝而成。微染色體重塑在HBV復(fù)制中起關(guān)鍵作用，而HBV復(fù)制依賴于乙肝病毒X蛋白（HBx）的存在。本研究將進(jìn)一步明確HBx除了調(diào)控cccDNA招募的組蛋白H3乙�；揎椧酝猓欠襁�調(diào)控HBV復(fù)制相關(guān)的其他微染色體重塑。 方法:運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建HBx缺失突變型質(zhì)粒，用SapI酶單酶切野生型HBV全長基因組的質(zhì)粒和HBx缺失突變型質(zhì)粒，將獲得的線性野生型和HBx缺失突變型HBV基因組DNA分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，研究HBx對(duì)病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、病毒抗原分泌以及cccDNA招募的組蛋白H3甲基化、磷酸化和乙酰化修飾的調(diào)控作用。 結(jié)果: HBx缺失雖然不影響cccDNA的合成，但是它能導(dǎo)致HBV復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和抗原分泌都顯著減少。cccDNA招募的組蛋白H3乙�；渭谆土姿峄寂cHBV復(fù)制密切相關(guān)，而且在HBx突變組中cccDNA招募的組蛋白H3單甲基化、磷酸化和乙�；揎椝蕉急纫吧M的水平顯著降低。在HepG2細(xì)胞中HBx不僅調(diào)控HBV復(fù)制相關(guān)的cccDNA招募的組蛋白H3乙酰化修飾，而且調(diào)控cccDNA招募的組蛋白H3甲基化和磷酸化修飾。 結(jié)論: HBx對(duì)HBV復(fù)制相關(guān)的微染色體重塑有重要調(diào)控作用。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R512.62
【圖文】：

2 結(jié)果2.1 HBx 缺失突變質(zhì)粒pUC-HBV1.0.X7 的鑒定以 pUC-HBV1.0 為模板進(jìn)行 PCR 定點(diǎn)突變，PCR 突變產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖電泳后見 5800 bp 的條帶（帶缺刻的開環(huán)的 HBx 缺失突變質(zhì)粒），符合預(yù)期結(jié)果(圖 1A)突變產(chǎn)物經(jīng) DpnI酶消化模板質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌 DH 5α，隨機(jī)挑起 4 個(gè)白色菌落。用 HindIII 和 SacI 酶雙酶切抽提的質(zhì)粒，其酶切產(chǎn)物經(jīng)1% 的瓊脂糖電泳后3200 bp HBx 缺失突變型 HBVDNA 片段和2600 bp pUC19 載體片段（圖 1B）。酶切結(jié)果正確的質(zhì)粒送大連寶生物公司 DNA 測序，測序結(jié)果示 HBx 讀碼框中第 7 位氨基酸引入終止密碼，即將第 8 位谷氨酰胺 Gln 的密碼子 CAA 突變?yōu)榻K止密碼TAA，也與預(yù)期結(jié)果相符（圖 1C）。這表明 HBx 缺失突變質(zhì)粒 pUC-HBV1.0.X7 構(gòu)建成功。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文.2 野生型和 HBx 缺失突變型 HBV 細(xì)胞復(fù)制模型的構(gòu)建.2.1 線性 HBV DNA 的獲得用 SapI 單 酶 切 野 生 型 質(zhì) 粒 pUC-HBV1.0 和 HBx 缺 UC-HBV1.0.X7，其酶切產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳后見3200 bp HBV DNAUC19 載體片段（圖2A）,切下 3200 bp 條帶的凝膠，經(jīng)膠回收純化脂糖電泳后只見3200 bpHBVDNA 片段（圖2B）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 周贊虎;張永祥;陳枝華;劉仁海;田蘊(yùn);鄭天凌;;基因改造中快速PCR定點(diǎn)突變方法應(yīng)用[J];中國公共衛(wèi)生;2007年01期

本文編號(hào)：2716652