【摘要】：肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是肝臟對(duì)各種慢性刺激進(jìn)行損傷修復(fù)反應(yīng)時(shí),以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在肝內(nèi)大量沉積的病理過程。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)在肝纖維化形成過程中居核心地位。越來越多的研究表明,肝纖維化是可以自發(fā)逆轉(zhuǎn)恢復(fù)的,而活化的HSC凋亡是其逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵。肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中,腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL)起了重要的凋亡誘導(dǎo)作用。前期研究發(fā)現(xiàn),肝纖維化形成與逆轉(zhuǎn)過程中大鼠枯否細(xì)胞(kupffer cell, KC)分泌TRAIL增加,HSC表達(dá)TRAIL死亡受體DR4、DR5也明顯增加。這就提出了一個(gè)問題:肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中,TRAIL及其死亡受體表達(dá)增加,HSC表現(xiàn)為凋亡;而肝纖維化形成過程中TRAIL及其死亡受體表達(dá)亦增加,HSC為何表現(xiàn)為增殖?細(xì)胞型Fas相關(guān)死亡域樣白介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(c-FLIP),通過抑制Caspase-8,阻斷死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)的形成,調(diào)節(jié)TRAIL凋亡通路;鑒于c-FLIP在調(diào)節(jié)TRAIL凋亡通路中的重要作用,本研究擬選用CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)模型,研究c-FLIP在肝纖維化不同時(shí)期的表達(dá)及對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的HSC凋亡的影響,并進(jìn)一步探討調(diào)控c-FLIP蛋白的信號(hào)通路以及來氟米特(leflunomide,Lef)促進(jìn)HSC凋亡的作用機(jī)制。研究?jī)?nèi)容主要包括以下三個(gè)部分: 1.大鼠肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)模型的制備 為探討肝纖維化不同時(shí)期HSC對(duì)TRAIL凋亡敏感性的機(jī)制,我們利用CCl4誘導(dǎo)大鼠12周,自發(fā)逆轉(zhuǎn)4周,建立肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)模型。結(jié)果顯示:與肝纖維化模型組比較,逆轉(zhuǎn)期大鼠ALT、AST明顯降低,反應(yīng)肝纖維化程度的血清學(xué)指標(biāo)(HA,HA,LN,PCⅢ,CⅣ)和組織學(xué)指標(biāo)組織羥脯氨酸含量(Hydroxyproline,Hyp)亦明顯降低;病理組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)期肝組織中膠原的含量明顯下降,同時(shí)膠原纖維向組織內(nèi)延伸的程度也明顯降低;免疫組織化學(xué)檢測(cè)HSC活化的標(biāo)志α-SMA發(fā)現(xiàn),逆轉(zhuǎn)期肝組織中活化的HSC與模型組比較明顯減少。以上結(jié)果提示肝纖維化逆轉(zhuǎn)動(dòng)物模型建立成功。 2. c-FLIPL在肝纖維化形成與逆轉(zhuǎn)過程中的表達(dá)及對(duì)TRAIL誘導(dǎo)HSC凋亡的調(diào)控作用研究 原位灌流提取大鼠肝纖維化不同時(shí)期HSC,以外源性TRAIL誘導(dǎo)其凋亡,通過DNA ladder及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),肝纖維化逆轉(zhuǎn)期HSC凋亡率較模型組HSC明顯增加,逆轉(zhuǎn)期HSC中caspase-3活性明顯高于模型組;檢測(cè)肝組織及HSC中c-FLIPL表達(dá)發(fā)現(xiàn),肝纖維化逆轉(zhuǎn)期肝組織及HSC中c-FLIPL表達(dá)與模型組比較明顯降低;通過siRNA干擾模型組c-FLIPL表達(dá),則明顯增加TRAIL誘導(dǎo)的HSC凋亡率;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),肝纖維化逆轉(zhuǎn)期HSC中p-Akt、mTOR及p-p70S6K表達(dá)與模型組比較明顯減少,利用磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases, PI3K)抑制劑LY294002及雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制劑雷帕霉素,可明顯抑制c-FLIPL表達(dá),增加HSC對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性;利用siRNA抑制模型組核糖體40S小亞基S6K蛋白激酶(p70S6K)表達(dá),亦可明顯增加TRAIL誘導(dǎo)的HSC凋亡率。以上結(jié)果提示肝纖維化不同時(shí)期c-FLIPL表達(dá)的改變影響HSC對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性,PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信號(hào)途徑,在肝纖維化形成過程中,通過增加c-FLIPL表達(dá)抑制了TRAIL誘導(dǎo)的HSC凋亡。 3.來氟米特促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)的HSC-T6凋亡的機(jī)制研究 Lef為免疫調(diào)節(jié)劑,可促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)的HSC凋亡,但其具體作用機(jī)制還不明確。研究發(fā)現(xiàn):Lef預(yù)處理HSC-T6細(xì)胞,可顯著抑制Leptin誘導(dǎo)活化的HSC-T6中c-FLIPL蛋白表達(dá),呈劑量依賴性;并明顯增加caspase-3的活性,同時(shí)活化的HSC-T6凋亡率亦明顯增高;提示Lef可能通過抑制HSC-T6中c-FLIPL的表達(dá),促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)的HSC凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Lef預(yù)處理HSC-T6細(xì)胞可顯著抑制Leptin誘導(dǎo)活化的HSC-T6中p-Akt、mTOR及p-p70S6K蛋白表達(dá),促進(jìn)HSC-T6的凋亡。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,Lef可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路,抑制c-FLIPL蛋白的表達(dá),增加HSC對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡敏感性。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R575.2
【圖文】：

圖 1 大鼠肝組織病理學(xué)檢測(cè)(HE 染色×100)A：對(duì)照組大鼠肝組織；B：CCl4誘導(dǎo) 12 周大鼠肝組織；C：CCl4誘導(dǎo) 12 周后停藥 4 周大肝組織Fig.1 Photomicrographs of liver sections stained with haematoxylin eosin (HE×100).A: Control; B: Model; C: 4w spontaneous recovery after injecting CCl412wMasson 染色：正常大鼠肝臟無明顯膠原纖維增生(圖 2A)；CCl4誘導(dǎo) 12 周大鼠的肝臟組織有大量纖維形成，匯管區(qū)明顯增生，并向肝小葉內(nèi)延伸，形成厚薄不一的纖維隔，分割包繞肝小葉，局部有假小葉形成(圖 2B)；停止 CCl4誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn) 4 周大鼠組織中可見少量膠原纖維，形成間斷的纖維間隔，無明顯假小葉形成，與 CCl4導(dǎo) 12 周大鼠的肝臟組織相比，其肝組織膠原纖維增生明顯減少(圖 2C) (表 1)。

圖 1 大鼠肝組織病理學(xué)檢測(cè)(HE 染色×100)A：對(duì)照組大鼠肝組織；B：CCl4誘導(dǎo) 12 周大鼠肝組織；C：CCl4誘導(dǎo) 12 周后停藥 4 周大鼠肝組織Fig.1 Photomicrographs of liver sections stained with haematoxylin eosin (HE×100).A: Control; B: Model; C: 4w spontaneous recovery after injecting CCl412wMasson 染色：正常大鼠肝臟無明顯膠原纖維增生(圖 2A)；CCl4誘導(dǎo) 12 周大鼠的肝臟組織中有大量纖維形成，匯管區(qū)明顯增生，并向肝小葉內(nèi)延伸，形成厚薄不一的纖維間隔，分割包繞肝小葉，局部有假小葉形成(圖 2B)；停止 CCl4誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn) 4 周大鼠肝組織中可見少量膠原纖維，形成間斷的纖維間隔，無明顯假小葉形成，與 CCl4誘導(dǎo) 12 周大鼠的肝臟組織相比，其肝組織膠原纖維增生明顯減少(圖 2C) (表 1)。A B C

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2715916