【摘要】：肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是肝臟對各種慢性刺激進行損傷修復反應時,以膠原為主的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)在肝內大量沉積的病理過程。肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)在肝纖維化形成過程中居核心地位。越來越多的研究表明,肝纖維化是可以自發(fā)逆轉恢復的,而活化的HSC凋亡是其逆轉的關鍵。肝纖維化逆轉過程中,腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL)起了重要的凋亡誘導作用。前期研究發(fā)現(xiàn),肝纖維化形成與逆轉過程中大鼠枯否細胞(kupffer cell, KC)分泌TRAIL增加,HSC表達TRAIL死亡受體DR4、DR5也明顯增加。這就提出了一個問題:肝纖維化逆轉過程中,TRAIL及其死亡受體表達增加,HSC表現(xiàn)為凋亡;而肝纖維化形成過程中TRAIL及其死亡受體表達亦增加,HSC為何表現(xiàn)為增殖?細胞型Fas相關死亡域樣白介素-1β轉換酶抑制蛋白(c-FLIP),通過抑制Caspase-8,阻斷死亡誘導信號復合物(DISC)的形成,調節(jié)TRAIL凋亡通路;鑒于c-FLIP在調節(jié)TRAIL凋亡通路中的重要作用,本研究擬選用CCl4誘導的肝纖維化自發(fā)逆轉模型,研究c-FLIP在肝纖維化不同時期的表達及對TRAIL誘導的HSC凋亡的影響,并進一步探討調控c-FLIP蛋白的信號通路以及來氟米特(leflunomide,Lef)促進HSC凋亡的作用機制。研究內容主要包括以下三個部分: 1.大鼠肝纖維化自發(fā)逆轉模型的制備 為探討肝纖維化不同時期HSC對TRAIL凋亡敏感性的機制,我們利用CCl4誘導大鼠12周,自發(fā)逆轉4周,建立肝纖維化自發(fā)逆轉模型。結果顯示:與肝纖維化模型組比較,逆轉期大鼠ALT、AST明顯降低,反應肝纖維化程度的血清學指標(HA,HA,LN,PCⅢ,CⅣ)和組織學指標組織羥脯氨酸含量(Hydroxyproline,Hyp)亦明顯降低;病理組織學檢測發(fā)現(xiàn)逆轉期肝組織中膠原的含量明顯下降,同時膠原纖維向組織內延伸的程度也明顯降低;免疫組織化學檢測HSC活化的標志α-SMA發(fā)現(xiàn),逆轉期肝組織中活化的HSC與模型組比較明顯減少。以上結果提示肝纖維化逆轉動物模型建立成功。 2. c-FLIPL在肝纖維化形成與逆轉過程中的表達及對TRAIL誘導HSC凋亡的調控作用研究 原位灌流提取大鼠肝纖維化不同時期HSC,以外源性TRAIL誘導其凋亡,通過DNA ladder及流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn),肝纖維化逆轉期HSC凋亡率較模型組HSC明顯增加,逆轉期HSC中caspase-3活性明顯高于模型組;檢測肝組織及HSC中c-FLIPL表達發(fā)現(xiàn),肝纖維化逆轉期肝組織及HSC中c-FLIPL表達與模型組比較明顯降低;通過siRNA干擾模型組c-FLIPL表達,則明顯增加TRAIL誘導的HSC凋亡率;進一步研究發(fā)現(xiàn),肝纖維化逆轉期HSC中p-Akt、mTOR及p-p70S6K表達與模型組比較明顯減少,利用磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases, PI3K)抑制劑LY294002及雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制劑雷帕霉素,可明顯抑制c-FLIPL表達,增加HSC對TRAIL誘導凋亡的敏感性;利用siRNA抑制模型組核糖體40S小亞基S6K蛋白激酶(p70S6K)表達,亦可明顯增加TRAIL誘導的HSC凋亡率。以上結果提示肝纖維化不同時期c-FLIPL表達的改變影響HSC對TRAIL誘導凋亡的敏感性,PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信號途徑,在肝纖維化形成過程中,通過增加c-FLIPL表達抑制了TRAIL誘導的HSC凋亡。 3.來氟米特促進TRAIL誘導的HSC-T6凋亡的機制研究 Lef為免疫調節(jié)劑,可促進TRAIL誘導的HSC凋亡,但其具體作用機制還不明確。研究發(fā)現(xiàn):Lef預處理HSC-T6細胞,可顯著抑制Leptin誘導活化的HSC-T6中c-FLIPL蛋白表達,呈劑量依賴性;并明顯增加caspase-3的活性,同時活化的HSC-T6凋亡率亦明顯增高;提示Lef可能通過抑制HSC-T6中c-FLIPL的表達,促進TRAIL誘導的HSC凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)Lef預處理HSC-T6細胞可顯著抑制Leptin誘導活化的HSC-T6中p-Akt、mTOR及p-p70S6K蛋白表達,促進HSC-T6的凋亡。以上實驗結果提示,Lef可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,抑制c-FLIPL蛋白的表達,增加HSC對TRAIL誘導的凋亡敏感性。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R575.2
【圖文】：

圖 1 大鼠肝組織病理學檢測(HE 染色×100)A：對照組大鼠肝組織；B：CCl4誘導 12 周大鼠肝組織；C：CCl4誘導 12 周后停藥 4 周大肝組織Fig.1 Photomicrographs of liver sections stained with haematoxylin eosin (HE×100).A: Control; B: Model; C: 4w spontaneous recovery after injecting CCl412wMasson 染色：正常大鼠肝臟無明顯膠原纖維增生(圖 2A)；CCl4誘導 12 周大鼠的肝臟組織有大量纖維形成，匯管區(qū)明顯增生，并向肝小葉內延伸，形成厚薄不一的纖維隔，分割包繞肝小葉，局部有假小葉形成(圖 2B)；停止 CCl4誘導逆轉 4 周大鼠組織中可見少量膠原纖維，形成間斷的纖維間隔，無明顯假小葉形成，與 CCl4導 12 周大鼠的肝臟組織相比，其肝組織膠原纖維增生明顯減少(圖 2C) (表 1)。

圖 1 大鼠肝組織病理學檢測(HE 染色×100)A：對照組大鼠肝組織；B：CCl4誘導 12 周大鼠肝組織；C：CCl4誘導 12 周后停藥 4 周大鼠肝組織Fig.1 Photomicrographs of liver sections stained with haematoxylin eosin (HE×100).A: Control; B: Model; C: 4w spontaneous recovery after injecting CCl412wMasson 染色：正常大鼠肝臟無明顯膠原纖維增生(圖 2A)；CCl4誘導 12 周大鼠的肝臟組織中有大量纖維形成，匯管區(qū)明顯增生，并向肝小葉內延伸，形成厚薄不一的纖維間隔，分割包繞肝小葉，局部有假小葉形成(圖 2B)；停止 CCl4誘導逆轉 4 周大鼠肝組織中可見少量膠原纖維，形成間斷的纖維間隔，無明顯假小葉形成，與 CCl4誘導 12 周大鼠的肝臟組織相比，其肝組織膠原纖維增生明顯減少(圖 2C) (表 1)。A B C

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

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2 張磊;黃成;李俊;呂雄文;朱鵬里;王建青;李增;賀曉昕;;大鼠肝星狀細胞和枯否細胞的分離與培養(yǎng)方法[J];安徽醫(yī)科大學學報;2007年06期

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4 謝仕斌,姚集魯,鄭榮琴,彭曉謀,高志良;血清HA、PCⅢ、CⅣ定量對肝組織纖維化診斷的意義[J];中華肝臟病雜志;2001年06期

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相關博士學位論文 前1條

1 張磊;肝纖維化恢復期Kuffer cell對HSC凋亡的調控作用及信號轉導機制研究[D];安徽醫(yī)科大學;2008年

本文編號：2715916