【摘要】：全球目前約有3.6億慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染者,其中約有10%左右發(fā)展為肝硬化甚至肝癌,每年死于HBV所致疾病人數(shù)在50萬到120萬。免疫系統(tǒng)在HBV慢性感染的病程和轉(zhuǎn)歸中起著至關(guān)重要的作用,慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者體內(nèi)免疫功能異常,抗HBV特異性細胞免疫功能低下,主要表現(xiàn)為抗病毒相關(guān)的細胞因子分泌低下及病毒在體內(nèi)的持續(xù)存在。近期研究表明,程序性死亡蛋白-1(programmed death-1, PD-1)及其配體(B7-H1,即PD-L1)與感染的慢性化有關(guān),阻斷PD-1與其配體B7-H1(PD-L1)的結(jié)合,可增強T細胞的抗病毒作用。本研究擬通過體內(nèi)阻斷PD-1/PD-L1途徑,改善HBsAg免疫刺激HBV轉(zhuǎn)基因小鼠抗HBV免疫功能,為治療慢性乙型肝炎探尋新方法。 目的: 應(yīng)用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型,觀察B7-H1蛋白疫苗免疫后對PD-1/PD-L1的阻斷效果及其是否能夠增強對HBsAg的免疫應(yīng)答。 方法: ①15只HBV Tg雌性小鼠隨機分為HBsAg組、重組人B7-H1聯(lián)合HBsAg組、生理鹽水對照組。②HBsAg組每只小鼠腹腔注射HBsAg 200μL(含HBsAg 10μg);B7-H1聯(lián)合HBsAg組腹腔注射HBsAg(含HBsAg 10μg)及重組人B7-H1(含B7-H1 40μg),終體積為200μl;生理鹽水對照組腹腔注射200μL生理鹽水;各組小鼠每兩周免疫/注射1次,共4次,末次免疫后2周處死小鼠取脾。③3組小鼠均在免疫前1天及免疫后2、4、6、8周經(jīng)眶后靜脈叢穿刺采血,每次采血0.3～0.5 mL,高速離心(13000 r/ min,10 min)后收集上清置-20℃冰箱保存?zhèn)溆�。④記�?組小鼠免疫前體重、HBsAg定量,比較各組之間有無差異。⑤應(yīng)用ELISA方法檢測B7-H1蛋白疫苗免疫后2、4、6、8周血清抗體滴度。⑥應(yīng)用HBsAb ELISA試劑盒檢測各試驗組產(chǎn)生抗乙肝病毒表面抗原抗體(抗-HBs)的水平。⑦按常規(guī)制備脾細胞懸液,應(yīng)用HBsAg刺激后觀察各組脾細胞產(chǎn)生IL-2和IFN-γ的量。⑧應(yīng)用ELISPOT試劑盒檢測各實驗組小鼠分泌HBsAg特異性IFN-γT細胞的數(shù)量。⑨用MTT法檢測各組淋巴細胞增殖功能。⑩在統(tǒng)計學軟件SPSS中分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)均以?x±s表示,以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果 ①3組Tg小鼠的平均體重分別為27.2±0.96g、26.6±0.55g、27.1±0.752g;3組小鼠免疫前血清HBsAg滴度分別為5307.9±437.8IU/mL、5335.4±523.5IU/mL和5554.8±439.5IU/mL;3組小鼠無論是體重還是免疫前HBsAg滴度均未見明顯差異。②B7-H1蛋白疫苗免疫小鼠后,血清抗體滴度隨免疫次數(shù)的增加而升高,并可維持較高的滴度。③免疫治療6周、8周,HBsAg組及HBsAg+B7-H1組均100%出現(xiàn)表面抗原抗體,對照組始終為陰性,但HBsAg組及HBsAg+B7-H1組兩組之間抗體滴度無明顯差異(P0.05)。④HBsAg組及HBsAg+B7-H1組所誘生的Th1類細胞因子(IL-2、IFN-γ)的水平與生理鹽水對照組相比明顯增高(P0.05), IL-2分別為306.7±94.8pg/ml、327.9±109.6pg/ml、124.5±55.7pg/ml , IFN-γ分別為569.0±132.1pg/ml、647.8±161.8pg/ml、99.2±50.2pg/ml,但HBsAg組及HBsAg+B7-H1組之間無顯著性差異(P0.05)。⑤HBsAg單獨免疫及HBsAg+B7-H1聯(lián)合免疫組小鼠脾細胞HBsAg特異性分泌IFN-γT細胞數(shù)量較生理鹽水對照組增加近1倍(P0.05),分別為57.8±5.4、52.4±4.5、23.6±3.6,但HBsAg與HBsAg+B7-H1兩組間無明顯差異(P0.05)。⑥淋巴細胞特異性增殖試驗中,HBsAg組及HBsAg+B7-H1組刺激指數(shù)(SI)明顯高于生理鹽水對照組,分別為2.29±0.30、2.30±0.36和1.33±0.26,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而HBsAg組與HBsAg+B7-H1組之間無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 結(jié)論: 1、HBsAg可以誘導乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生特異性的體液免疫,并可誘導產(chǎn)生高水平Th1類細胞因子(IL-2、IFN-γ),打破免疫耐受。 2、應(yīng)用B7-H1蛋白疫苗阻斷PD-1/PD-L1對HBsAg在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中的免疫效果無明顯影響,但仍需重復試驗加以證實。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R512.62
【圖文】：

HBsAg蛋白刺激小鼠淋巴細胞增殖

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2715676