【摘要】： 乙型肝炎病毒(HBV)感染是導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要病因之一,嚴(yán)重威脅人類的健康。作為一種非細(xì)胞毒性嗜肝病毒,HBV可在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,病毒本身并不造成肝細(xì)胞的破壞,但由此引起的免疫應(yīng)答一方面有利于清除病毒,另一方面也可導(dǎo)致肝臟損傷。傳統(tǒng)理論認(rèn)為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在抗HBV感染及其引起的免疫損傷中起主導(dǎo)作用,但是隨著肝臟天然免疫系統(tǒng)理論的提出,肝臟中的天然免疫細(xì)胞在HBV感染及其免疫致病中發(fā)揮的效應(yīng)引起學(xué)者們的高度重視,尤其是NK細(xì)胞在HBV感染中的作用越來越受到關(guān)注。研究表明NK細(xì)胞參與HBV感染后的免疫應(yīng)答,HBV逃逸NK細(xì)胞的清除作用與病毒持續(xù)性感染密切相關(guān)。同時(shí)慢性HBV感染者對于外界因素如化學(xué)毒物、酒精、細(xì)菌感染等刺激后肝細(xì)胞更加容易損傷,影響了肝臟后續(xù)的再生能力。 本研究通過對HBV DNA復(fù)制水平不同的病毒感染者進(jìn)行分組,探討NK細(xì)胞在HBV感染者免疫應(yīng)答中的作用,通過流式細(xì)胞術(shù)分析不同HBV感染狀態(tài)的病人外周血NK細(xì)胞的比例、功能、表面活化性受體和抑制性受體的表達(dá),發(fā)現(xiàn)HBVDNA病毒載量增高患者伴隨NKG2A+NK細(xì)胞比例升高,NKG2A抑制NK細(xì)胞抗病毒活性導(dǎo)致HBV持續(xù)感染,可能是HBV逃逸NK細(xì)胞攻擊的原因之一阻斷NKG2A有可能成為治療HBV持續(xù)感染的靶點(diǎn)。同時(shí)在化學(xué)毒物誘導(dǎo)的小鼠模型中觀察到肝臟NK細(xì)胞對于肝臟損傷后再生的影響,為了解慢性HBV感染者在接觸化學(xué)毒物后NK細(xì)胞對于肝臟的修復(fù)能力提供研究基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果分以下兩部分： (一)NK細(xì)胞高表達(dá)NKG2A介導(dǎo)HBV慢性免疫逃逸 1.病毒復(fù)制限制性CHB病人NK細(xì)胞比例增高 在病毒復(fù)制水平受到限制的CHB病人(HBV DNA 105 copies/ml)外周血中NK細(xì)胞較正常對照組、病毒復(fù)制水平較高組和肝硬化病人明顯升高,并且與HBVDNA拷貝數(shù)和血清ALT呈明顯負(fù)相關(guān),說明NK細(xì)胞減少不利于HBV的清除和病情的緩解。進(jìn)一步對NK細(xì)胞的功能分析發(fā)現(xiàn)：IL-12體外刺激病毒復(fù)制限制性CHB病人NK細(xì)胞后,其分泌IFN-γ的能力要明顯高于高病毒復(fù)制的CHB病人和正常對照組；NK細(xì)胞殺傷試驗(yàn)證明,病毒復(fù)制限制性CHB病人與高病毒載量的CHB病人相比,NK細(xì)胞表達(dá)CD107a、殺傷K562細(xì)胞的能力明顯增強(qiáng)。 2.HBV DNA拷貝數(shù)升高患者伴隨NKG2A+NK細(xì)胞升高 對大量HBV病人進(jìn)行NK細(xì)胞活化性受體和抑制性受體檢測發(fā)現(xiàn),不同研究對象活化性受體NKG2D, NKG2C, NKp30, NKp44, NKp46,抑制性受體KIR2DL3, KIR3DL1,CD158b,CD158a等均無明顯改變,但抑制性受體NKG2A有明顯改變,在低拷貝病人中NKG2A的表達(dá)較低,在高拷貝病人和肝硬化病人中NKG2A+NK細(xì)胞比例明顯增高,并且與HBV DNA病毒載量和ALT表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系,說明NKG2A的高表達(dá)抑制了NK細(xì)胞的活化,不利于HBV清除和病情緩解。 3.阻斷NKG2A能恢復(fù)HBV持續(xù)感染者NK細(xì)胞功能,甚至清除HBV 通過殺傷試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),體外阻斷NKG2A之后,只有HBV DNA病毒載量高的病人外周血NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷能力增強(qiáng),而在正常對照組和低拷貝病人外周血中NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷能力沒有變化。并且在阻斷了NKG2A信號之后,純化的NK細(xì)胞對肝細(xì)胞系L02、肝癌細(xì)胞系HepG2和整合有HBV基因的肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15的殺傷功能也明顯增強(qiáng)。為了證明阻斷NKG2A后的體內(nèi)抗病毒效應(yīng),我們通過高壓注射HBV質(zhì)粒建立HBV感染小鼠模型,分別用抗NKG2A抗體和抗NKG2A的配體Qa-1的抗體進(jìn)行阻斷,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV感染小鼠血清中HBsAg,HBV DNA均顯著降低。提示阻斷NKG2A有可能成為治療HBV持續(xù)感染的靶點(diǎn)。 (二)NK細(xì)胞高分泌TNF-a抑制急性肝臟損傷后再生 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NK細(xì)胞對于清除HBV感染有重要作用,但同時(shí)NK細(xì)胞也可導(dǎo)致部分肝臟損傷,鑒于肝臟損傷均伴隨肝臟自身的再生修復(fù),本研究將進(jìn)一步探討NK細(xì)胞在肝臟再生的作用。我們采用了化學(xué)毒物CCl4誘導(dǎo)的肝臟損傷為肝臟再生模型,研究NK細(xì)胞的活化對于肝臟再生的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)鼠在同時(shí)注射了poly I:C和CCl4之后能夠明顯抑制肝臟再生,用AsGM1清除NK細(xì)胞或用NK1.1抗體清除NK1.1+細(xì)胞(包含NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞),poly I:C抑制的肝臟再生得到明顯恢復(fù),提示NK細(xì)胞參與肝臟再生抑制。其機(jī)理是poly I:C和CCl4能夠誘導(dǎo)肝臟中NK細(xì)胞的大量聚集和活化,細(xì)胞因子IFN-y和TNF-a的分泌明顯增高,并且體內(nèi)中和TNF-a而不是IFN-y之后肝臟再生功能得到恢復(fù)。這些結(jié)果表明在CCl4誘導(dǎo)的肝臟損傷模型中poly I:C活化的NK細(xì)胞通過分泌TNF-α抑制肝臟再生。 綜上所述,活化的NK細(xì)胞能夠抑制體內(nèi)HBV的復(fù)制,但NK細(xì)胞表面NKG2A的上調(diào)可使其失去抑制HBV的功能；過度活化的NK細(xì)胞在肝臟損傷后的修復(fù)過程中還可發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用。這些結(jié)果對于進(jìn)一步了解HBV逃逸天然免疫攻擊、導(dǎo)致慢性持續(xù)性感染以及肝炎的防治具有一定的指導(dǎo)意義。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R512.62
【圖文】：

HBV的基因結(jié)構(gòu)，引自(RehermannandNaseimbeniZoos)

HBv的復(fù)制過程，引自(Ganemandprincezoo4)

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 李婉玉;天然免疫和獲得性免疫等因素在慢性HBV感染中的作用研究[D];吉林大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 陳園園;野菊花中萜類、黃酮類化合物對免疫調(diào)節(jié)和肝保護(hù)的協(xié)同作用研究[D];鄭州大學(xué);2012年

本文編號：2715104