【摘要】： 第一部分C57小鼠骨髓源性內皮祖細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 目的:探討C57小鼠骨髓來源的內皮祖細胞(EPCs)的分離、培養(yǎng)和鑒定方法。 材料與方法:取C57小鼠股骨骨髓,采用密度梯度離心法Histopaque 1083分離出小鼠骨髓單個核細胞,在含有10%FBS、20ng/ml VEGF、1ng/ml bFGF的M199培養(yǎng)基中進行體外誘導、分化和擴增。培養(yǎng)7天后,去除未貼壁細胞,進行細胞鑒定,應用流式細胞儀檢測Sca-1及Flk-1(VEGF-R2);熒光倒置顯微鏡觀察EPCs吞噬DiI標記的乙酰低密度脂蛋白(DiI-AcLDL)和FITC標記的荊豆凝集素-1(FITC-UEA-1);血管形成實驗鑒定內皮祖細胞血管形成能力。 結果:在內皮條件下培養(yǎng)的骨髓源性單個核細胞,24h后逐漸貼壁,并逐漸伸出偽足樣突起,呈小桿狀或梭形,培養(yǎng)第4天貼壁細胞開始增殖,呈“集落”樣生長,外周梭形細胞較多,第7天梭形細胞顯著增多,部分視野觀察到梭形細胞首尾相連形成條索樣結構;細胞培養(yǎng)7天后流式細胞儀檢測細胞Flk-1及Sca-1雙陽性率達60.06±4.96%;細胞攝取DiI-acLDL呈紅色,攝取UEA-1呈綠色,雙陽性細胞成黃色,陽性率達89.03±6.11%;血管形成實驗顯示EPCs在ECMatrix~(TM)膠體上能形成管狀血管結構。 結論:通過本研究分離、培養(yǎng)方法可從C57小鼠骨髓中獲得較高純度的EPCs,且具有內皮細胞的特征和功能。 第二部分評價SDF-1α/CXCR4在四氯化碳誘導的肝纖維化小鼠EPCs歸巢中的作用 目的檢測四氯化碳(CCl4)誘導的肝纖維化小鼠模型肝臟SDF-1α/CXCR4及骨髓來源內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)CXCR4受體的表達,評價SDF-1α/CXCR4軸在EPCs肝纖維化歸巢中的作用。 方法選用6周齡雌性純系C57小鼠,采用40%的CCl4/橄欖油溶液腹腔注射,劑量為1ml/kg,每周2次,共4周,制成肝纖維化模型,取肝纖維化及正常對照組小鼠肝臟標本,采用RT-PCR及免疫組化檢測SDF-1α的表達,采用RT-PCR及Western檢測CXCR4受體的表達:分離、培養(yǎng)骨髓來源的EPCs,采用Transwell小室檢測BM-EPCs對SDF-1α的遷移功能,流式細胞術檢測BM-EPCs CXCR4的表達。 結果與對照組相比,SDF-1α及CXCR4在肝纖維化模型小鼠肝臟組織中的表達較對照組明顯上調,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);BM-EPCs CXCR4的表達陽性率為(69.35%±16.04%),Transwell遷移實驗顯示,BM-EPCs向SDF-1α的遷移數(shù)量是158.40±12.66/高倍視野,明顯高于正常組(87.80±14.24/高倍視野)((P＜0.01,t=8.29),在體外經CXCR4受體抑制劑AMD3100處理后,BM-EPCs向SDF-1α遷移的數(shù)量顯著減少(92.60±13.59/高倍視野)(P＜0.01)。 結論SDF-1α/CXCR4軸在EPCs肝纖維化歸巢中具有重要作用,為EPCs移植治療肝纖維化提供了理論基礎。 第三部分3.0-T磁共振R2~*和R2 mapping在SPIO標記內皮祖細胞向肝纖維化肝臟歸巢的活體定量示蹤研究 目的:評價臨床用3.0T磁共振R2~*和R2 mapping定量示蹤SPIO標記的內皮祖細胞(EPCs)向肝臟歸巢。 方法:C57小鼠骨髓來源EPCs培養(yǎng)7d,并進行標記物鑒定,進行氧化鐵顆粒-魚精蛋白(FE-PRO)標記。用電鏡和普魯士藍染色來評價鐵顆粒攝取。制做不同濃度標記細胞(0-2.0×10~6/ml)的1.0%瓊脂糖模型,并采用臨床用3.0T磁共振進行R2和R2~*測定;活體示蹤:選用純系C57小鼠(雌性,6周齡,體重19g-20g),腹腔內注射40%CCL4橄欖油溶液制成肝纖維化模型,經鼠尾靜脈注射5.0×10~6個SPIO標記的EPCs懸液(0.5ml),在注射前及注射后2h、4d、8d及12d行磁共振掃描測定肝臟R2~*和R2值,對照組小鼠接受同樣劑量SPIO標記和未標記的EPCs移植,并行磁共振掃描,移植后12d所有小鼠均處死行組織病理學觀察。 結果:電鏡和普魯士藍染色顯示SPIO鐵顆粒標記率達95%以上,與正常細胞相比未見細胞器結構損傷;R2和R2~*值與瓊脂糖凝膠模型中標記細胞的數(shù)量成正比(r分別為0.98及0.99,P＜0.01),R2~*效應較R2效應明顯(P＜0.01);活體磁共振細胞示蹤成像顯示,肝纖維化及正常小鼠肝臟R2~*值在注射SPIO標記的EPCs后2h、4d、8d均明顯高于對照組(P均小于0.05),R2~*值隨時間延長逐漸減低;注射標記SPIO的細胞后肝纖維化小鼠肝臟R2~*值在注射后2h、4d、8d均明顯高于正常組(P均小于0.05);肝纖維化及正常小鼠肝臟R2值在注射SPIO標記的EPCs后2h及4d均明顯高于對照組(P均小于0.05),R2值亦隨時間延長逐漸減低;肝纖維化小鼠肝臟R2值在注射SPIO標記的EPCs后各時間段與正常組無明顯差別(P均大于0.05);各組小鼠的R2~*值均明顯高于R2值,具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。 結論:3.0T MR R2~*和R2 mapping能定量示蹤移植細胞向肝臟歸巢,R2~*mapping優(yōu)于R2mapping,為臨床細胞移植治療提供了一種無創(chuàng)、準確的示蹤方法。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R575.2
【圖文】：

四.細胞培養(yǎng)方法1.骨髓單個核細胞的分離采用密度梯度離心法(圖1一l)，具體步驟為:將小鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡15分鐘，在超凈臺內無菌條件下剪取雙下肢股骨和脛骨，將srul注射器接lml注射器針頭，吸取預冷至4℃的PBS液沖洗股骨及脛骨骨髓腔，直至沖洗液清亮或骨髓腔變白，反復吹打沖洗液以獲得單細胞懸液，然后將骨髓單細胞懸液緩慢滴加在 Histopaquel083淋巴細胞分離液上，沖洗液與分離液的體積比為2:1

..!戶口C圖卜7共檢測6組細胞，每組細胞測定二次，結果顯示Sca一1/Flk一1雙l樸哇率為60.06十4.%%圖1一8圖1一9圖l一10圖1一8熒光倒置顯微鏡觀察細胞吞噬Dil一LDL星紅色;色。(放大倍數(shù)400x)細胞吞噬FITC一uEA一l旱綠色;圖1一9熒光倒置顯微鏡觀察熒光倒置顯微鏡示細胞吞噬DII一LOL及FITC一UEA一1雙染旱黃22

【參考文獻】

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1 張文奪,符偉國,徐欣,王玉琦,夏蓓莉,汪圣毅;臍血內皮祖細胞的分離和培養(yǎng)[J];中國臨床醫(yī)學;2005年01期

2 Claudia Rubie;Vilma Oliveira Frick;Mathias Wagner;Christina Weber;Bianca Kruse;Katja Kempf;Jochen K銉nig;Bettina Rau;Martin Schilling;;Chemokine expression in hepatocellular carcinoma versus colorectal liver metastases[J];World Journal of Gastroenterology;2006年41期

3 石立興;張繼武;;光學分子影像學及其應用[J];中國醫(yī)學影像技術;2008年12期

本文編號：2712898