【摘要】：研究背景:非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是導(dǎo)致肝硬化、肝癌的高危因素,但其發(fā)病機(jī)制未明,故治療手段有限。近年來發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞代謝在NAFLD中發(fā)揮重要作用,叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1(Forkhead Box O1,FoxO1)被認(rèn)為在調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和脂質(zhì)代謝中起著重要作用。NAFLD進(jìn)展過程中伴隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和壞死性凋亡,然而FoxO1在非酒精性脂肪性肝病中調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和壞死性凋亡的關(guān)系尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)通過研究FoxO1在非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中的作用,并采用體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)、FoxO1抑制劑AS1842856初步探討FoxO1調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及壞死性凋亡緩解NAFLD發(fā)展的作用,旨在為NAFLD的治療尋找新靶點(diǎn)提供新思路。目的:探討FoxO1對NAFLD內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和壞死性凋亡的影響,靶向抑制FoxO1后緩解NAFLD發(fā)生發(fā)展的作用及機(jī)制研究方法:一、FoxO1在NAFLD發(fā)展中的作用研究1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):構(gòu)建NAFLD小鼠模型,通過檢測血清甘油三酯、血清膽固醇、油紅染色和HE染色鑒定NAFLD模型是否構(gòu)建成功。采用Western Blot檢測正常和NAFLD小鼠肝臟中FoxO1和p-FoxO1的表達(dá)水平。2、體外實(shí)驗(yàn):構(gòu)建NAFLD細(xì)胞模型:選擇人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞作為研究對象,使用不同濃度的棕櫚酸處理培養(yǎng)基,選取最佳濃度培養(yǎng)細(xì)胞24h。采用Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)FoxO1和p-FoxO1的表達(dá)水平。二、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和壞死性凋亡在NAFLD發(fā)展中的作用研究1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):構(gòu)建NAFLD小鼠模型,采用Western Blot檢測肝臟內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(PERK、BIP、CHOP)、壞死性凋亡相關(guān)蛋白(RIP1、RIP3、p-MLKL)的表達(dá)水平。2、體外實(shí)驗(yàn):構(gòu)建NAFLD細(xì)胞模型,采用Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(PERK、BIP、CHOP)、壞死性凋亡相關(guān)蛋白(RIP1、RIP3、p-MLKL)的表達(dá)水平。三、FoxO1調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和壞死性凋亡影響NAFLD發(fā)展的機(jī)制研究1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):將C57BL/6小鼠分為三組:對照組、高脂飲食組、高脂飲食+FoxO1抑制劑組,16周后通過Western Blot檢測小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(PERK、BIP、CHOP)、壞死性凋亡相關(guān)蛋白(RIP1、RIP3、p-MLKL)的表達(dá)水平;電鏡觀察小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)。2、體外實(shí)驗(yàn):構(gòu)建NAFLD細(xì)胞模型:1.0umol/L濃度的FoxO1抑制劑AS1842856預(yù)處理HepG2細(xì)胞2h,用0.75mmol/L濃度的棕櫚酸培養(yǎng)HepG2細(xì)胞24h;Western Blot檢測HepG2細(xì)胞總FoxO1和p-FoxO1蛋白,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(PERK、BIP、CHOP)、壞死性凋亡相關(guān)蛋白(RIP1、RIP3、p-MLKL);qRT-PCR檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)FoxO1下游基因CDKN1B mRNA、PMAIP1 mRNA、BCL2L11 mRNA和TNFSF10 mRNA表達(dá)量.結(jié)果:1、高脂飲食可使小鼠體重增加,ALT、AST、TC、TG升高,小鼠肝臟脂肪變性,同時(shí)肝臟FoxO1激活,磷酸化FoxO1減少。隨著棕櫚酸濃度升高,HepG2細(xì)胞FoxO1表達(dá)升高,p-FoxO1表達(dá)減少,證明FoxO1參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展。2、高脂飲食可以激活小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和壞死性凋亡。隨著棕櫚酸濃度升高,HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和壞死性凋亡相關(guān)蛋白也表達(dá)升高,證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和壞死性凋亡參與NAFLD的發(fā)展過程。3、抑制FoxO1可以減少小鼠肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及壞死性凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷減輕。FoxO1抑制劑的使用可以減少HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和壞死性凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),FoxO1下游TRAIL mRNA表達(dá)減少,證明FoxO1可以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和壞死性凋亡影響NAFLD的發(fā)展,這一過程可能通過FoxO1下游靶基因TRAIL介導(dǎo)。結(jié)論:在NAFLD小鼠模型中,FoxO1通過加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和壞死性凋亡促進(jìn)NAFLD的進(jìn)程,靶向抑制FoxO1可通過TRAIL減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、壞死性凋亡逆轉(zhuǎn)NAFLD。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575
【圖文】：

圖 1 高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠肝臟脂肪變性。（A）對照組和高脂組小鼠體重增長變化（n=6～8）；（B）對照組和高脂組小鼠肝臟圖片；（C）對照組和高脂組小鼠肝重比（n=6～8）；(D～G) 對照組和高脂組小鼠血清 TC、TG、ALT、AST 含量（n=6～8）；（H）對照組和高脂組小鼠肝臟 HE 染色和油紅染色。*p＜0.05，**p＜0.005，****p＜0.00005 與對照組相比。

圖 2 高脂喂養(yǎng)對小鼠肝臟 FoxO1 表達(dá)的影響。（A）Western Blot 檢測對照組和高脂組肝臟 FoxO1 和 p-FoxO1 表達(dá)情況。（B）定量對照組和高脂組肝臟 FoxO1和 p-FoxO1 表達(dá)情況。*p＜0.05，**p＜0.005，與對照組相比。

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本文編號：2712985