本文關鍵詞：利用PNA-PCR法早期檢測乙型病毒性肝炎YMDD耐藥變異，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 抗病毒治療是慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B, CHB)治療的關鍵。目前應用于抗病毒治療的藥物主要分為兩大類：核苷(酸)類似物和干擾素。拉米夫定(LAM, lamivudine)是第一個被批準用于慢性乙型病毒性肝炎治療的藥物,它能夠有效的抑制乙型肝炎病毒的復制,可以顯著的降低血清中HBV DNA (hepatitis B virus DNA)的水平,促進HBeAg (hepatitis B e antigen)的血清學轉換,改善肝臟的炎癥活動,延緩或阻止肝臟疾病的進展,降低肝癌(HCC, Hepatocellular carcinoma)的發(fā)生率。由于其相對較低的價格,拉米夫定仍然是很多病人進行抗病毒治療的首選藥物,特別是在發(fā)展中國家。但是長期治療過程中產生耐藥是抗病毒治療的一個難題。拉米夫定治療一年的基因耐藥率是14-32%,治療2年、3年和4年后分別上升到38%、49%和66%。有些病人在出現(xiàn)病毒學突破后發(fā)生肝炎的急性惡化,導致肝臟失代償,甚至是死亡。耐藥后繼續(xù)拉米夫定的治療將不能獲得臨床益處。拉米夫定耐藥性的產生主要與HBV P基因逆轉錄(RT)酶區(qū)突變有關,這些突變位點大部分位于204位點即YMDD(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)基因序列,YMDD基因序列位于DNA聚合酶中心部位,是酶的催化區(qū),與核苷酸的親和力高,主要的改變是YMDD中M(蛋氨酸)被V(纈氨酸)成為YVDD(rtM204V)或是YMDD中的M(蛋氨酸)被I(異亮氨酸)取代,成為YIDD(rtM204I)也有少部分位于180位點L(亮氨酸)變?yōu)镸(蛋氨酸)。另外還有相關研究表明,YMDD變異還會影響其他核苷(酸)類似物的藥效,因為有共同的耐藥位點的緣故,還有可能會引起其他抗病毒藥物(如恩替卡韋)的耐藥,對于已經發(fā)生了rtM204V/I變異的患者,我們應該謹慎的選擇治療方案。YMDD變異的產生使得HBV DNA聚合酶的活性降低,所以新產生的突變的準種的復制能力低于野生株,屬于非優(yōu)勢株,但是隨著抗病毒藥物的應用,在抗病毒藥物及機體免疫力的作用下野生株即優(yōu)勢株的的復制能力逐漸被抗病毒藥物抑制,復制能力降低,野生株的數(shù)量逐漸減少甚至消失,剩余的變異的突變株轉為優(yōu)勢株,但是因為這種變異株的聚合酶區(qū)發(fā)生突變,拉米夫定對這種變異株的復制沒有抑制作用,變異的病毒開始繼續(xù)復制,隨著復制的進行,逐漸占主導地位,使患者體內的病毒數(shù)量激增,導致患者HBV-DNA和ALT的水平出現(xiàn)反彈。因此YMDD變異的快速檢測對于及早發(fā)現(xiàn)耐藥變異、避免耐藥的發(fā)生、對患者實施個體化治療方案具有重要意義。 目前用于臨床耐藥檢測的方法有很多種,PCR產物直接測序法(direct PCR sequencing), PCR產物克隆測序法,聚合酶-限制性片段長度多態(tài)性,反向雜交法(reverse hybridization assay),基因芯片(gene chip),限制片段質譜多態(tài)性技術(restriction fragment mass polymorphism,RFMP)等,目前被大家公認的耐藥檢測的是PCR產物直接測序法,Keefffe等認為PCR產物直接測序法應作為基因型耐藥檢測的金標準。但是該方法的靈敏度低,最低檢測限為20%,即突變株數(shù)量需達到整個病毒群的20%時,才能檢測到。因為存在這種缺陷,所以不能盡早發(fā)現(xiàn)病人的耐藥突變,所以需要一種靈敏性及特異性高的方法來及早發(fā)現(xiàn)突變來治療病人的臨床用藥。 PNA(peptide nucleic acid,PNA)即肽核酸是于1991年由哥本哈根大學的Riso實驗室的丹麥科學家Nielsen等首先設計合成。PNA的骨架由重復排列的N-(2-氨乙基)甘氨酸單位通過酰胺鍵連接而成,嘌呤和嘧啶堿基通過亞甲基羰基連接于骨架的氨基N上,由于不含有磷酸基團,故不帶電,為中性,與靶序列雜交時排斥力很小,形成的復合物非常穩(wěn)定。PNA的特性主要包括一下幾方面：1、PNA與DNA單鏈或RNA雜交體(PNA/DNA)的穩(wěn)定性較高：與相應DNA雙鏈相比,每增加一個堿基對,PNA/DNA解鏈的Tm值將增加1℃(O.lmol/l的NaCl中)。例如,一15堿基對DNA雙鏈的解鏈溫度為54℃,相應PNA/DNA的解鏈溫度就達到69℃。2、復合物的穩(wěn)定性不受鹽濃度的影響：PNA/DNA雜交形成的雙螺旋結構的穩(wěn)定性與介質的鹽濃度無關。在鹽離子強度較低時,PNA能與靶序列的單鏈DNA分子雜交,形成穩(wěn)定的復合物并且復合物的Tm值較高。PNA/DNA、PNA/RNA的結合比相應DNA/DNA、DNA/RNA的結合更穩(wěn)定,這是由PNA和DNA鏈之間缺乏靜電排斥所致。在低離子強度環(huán)境下,特別是在無Mg2+環(huán)境中,PNA也能與DNA雜交。利用這一特性,可通過適當調整介質的離子濃度設計PNA探針,與標本中的DNA或PNA雜交,這一應用主要是用于靶序列中點突變的檢測。3、PNA與互補DNA雜交結合時有很高的專一性,PNA/DNA堿基錯配雜交分子的不穩(wěn)定性比DNA/DNA堿基錯配雜交分子的不穩(wěn)定性更高。例如：在混合的PNA/DNA雜交分子中,如果15個堿基對中有一對錯配,則其解鏈溫度(Tm)下降8-20℃(平均降低15℃),兩對堿基錯配則完全不能雜交,而相應的DNA/DNA雜交分子中,一個堿基對配錯,解鏈溫度只降低4-16℃,(平均降度11℃)。因此,與DNA探針相比,較短的PNA探針可以進一步提高探針雜交的專一性。本研究正是利用PNA的這些特性,設計出針對HBV YMDD野生株的PNA探針。PNA探針與靶DNA單鏈結合后穩(wěn)定性高,且解鏈溫度高。如果在PCR反應中加入PNA探針,YMDD野生株DNA/PNA雜交體由于完全配對而具有較高的解鏈溫度；而變異株的DNA/PNA雜交體由于存在一個堿基的不配對而具有較低解鏈溫度。設計PCR的復性溫度高于變異株DNA/PNA雜交體的解鏈溫度,而高于野生株DNA/PNA雜交體的解鏈溫度；就能抑制YMDD野生株的擴增,從而選擇性的擴增變異株。 實驗目的 1.本研究擬建立一種更加靈敏的檢測HBV YMDD突變的方法-PNA-PCR法,通過該方法檢測已知病毒含量的不同比例混合的質粒的突變,與直接測序法相比較,驗證新方法的靈敏性及特異性。 2.通過對臨床核苷類藥物治療的病人耐藥檢測以及未治療的慢性乙型病毒性肝炎患者預存耐藥的檢測,驗證新方法在抗病毒治療過程中耐藥檢測的優(yōu)勢。 材料與方法 1.樣本來源：選用100例南方醫(yī)院2011年3-5月門診測序病人的標本,上述患者均接受拉米夫定治療且臨床懷疑或檢測耐藥,另外收集100例南方醫(yī)院感染內科門診2012年7月-11月未使用核苷(酸)類藥物治療的患者血清,及20例健康獻血者的血清,上述患者HBeAg陽性或陰性,無HIV,HCV,HDV等感染史,收集所有患者血清,儲存于-30℃。 2. HBV DNA提�。菏占颊哐�,使用凱杰公司的QIAamp DNA Blood MiniKit,根據操作說明從200μl血清中提取HBV DNA用于下一步操作。 3. HBV DNA逆轉錄酶區(qū)(Reverse Transcriptase region, RT)擴增：分別使用直接測序法及PNA-PCR法對HBV RT區(qū)進行擴增,直接測序法的產物送測序,PNA-PCR法的結果直接是用瓊脂糖凝膠電泳法來觀察。 4,。統(tǒng)計學分析：所有的數(shù)據均使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析,率的比較用χ2檢驗,P0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。 結果 1.新的耐藥檢測的方法PNA-PCR法的靈敏性及特異性與臨床常規(guī)測序方法的比較評價：在病毒含量較低的情況下,直接測序法只能檢測到10%的突變,而PNA-PCR法則可以檢測到0.01%的突變,檢測的靈敏性提高1000倍；在病毒含量較高的情況下,直接測序法可以檢測到0.01%的突變,PNA-PCR法可以檢測到0.001%的突變,檢測的靈敏性提高10倍�？傊�,直接測序法相比PNA-PCR法可以將耐藥突變檢測的靈敏性提高10～1000倍。 2. PNA-PCR法在臨床耐藥檢測中的應用： .(1).使用核苷(酸)類似物治療的患者HBV YMDD耐藥的檢測：在100例患者中有15例患者結果為PCR陰性,剩余85例患者用直接測序法檢測突變的結果為34例(YIDD為21例,YVDD為11例,YIDD+YVDD為2例),陽性率為40.0%。PNA-PCR法檢測突變結果為73例(YIDD為40例,YVDD為23例,YIDD+YVDD為10例),陽性率為85.9%,較直接測序法檢測的靈敏度大幅度提高。 (2)未使用核苷(酸)類似物治療的患者HBV YMDD耐藥檢測：在100例未經核苷(酸)類似物治療的患者中有21例患者使用PNA-PCR法檢測出存在YMDD自然突變陽性率為21%,20例健康獻血者的血清分別使用PNA-PCR法及PCR產物直接測序法檢驗,均未檢測到乙肝病毒,兩種方法的特異性好,未出現(xiàn)假陽性。 結論 1、PNA-PCR法在檢測乙肝病毒YMDD耐藥突變種具有較高的靈敏性及特異性,尤其是在血清低病毒拷貝是,與直接測序法相比,PNA-PCR法具有更高的靈敏性,檢測差異明顯； 2、PNA-PCR PNA-PCR法可以檢測出萬分之一的rtM204I或rtM204V耐藥突變株,從而可以提前監(jiān)測到耐藥準種的發(fā)生,為臨床抗病毒治療中耐藥準種的發(fā)生提供重要指標。 3、未經治療的HBV感染的患者體內存在YMDD的自然變異株,但是耐藥突變株的存在對于以后患者以后能否使用拉米夫定治療,還需要進一步研究。
【關鍵詞】：乙型肝炎病毒 慢性乙型病毒性肝炎 直接測序法 PNA-PCR法 YMDD變異 拉米夫定
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.62
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-27
• 第一章 PNA-PCR法在HBV YMDD耐藥基因檢測中的敏感性與特異性的評估27-38
• 1. 材料和方法27-33
• 2. 結果33-35
• 3. 討論35-38
• 第二章 PNA-PCR法在臨床耐藥檢測中的應用：分別用兩種方法來檢測臨床病人YMDD的耐藥變異38-52
• 1. 病例來源38
• 2. 材料與方法38-45
• 3. 結果45-49
• 4. 討論49-52
• 第三章 PNA-PCR法檢測未經治療的慢性乙型肝炎患者YMDD自然變異株52-63
• 1. 病例來源52-53
• 2. 材料與方法53-59
• 3. 結果59-60
• 4. 討論60-63
• 全文總結63-64
• 參考文獻64-72
• 致謝72-74

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1 劉新鈺,曹利,張漢榮;PCR熔解曲線法檢測乙型肝炎病毒變異株[J];臨床檢驗雜志;2004年06期

2 趙蕊,吳曉楓,陳陽;拉米夫定治療慢性乙型肝炎出現(xiàn)YMDD變異10例的臨床治療體會[J];遼寧藥物與臨床;2003年02期

3 張巖,王平忠,張穎,李羽,魏欣,洪沙,李光玉,白雪帆;乙型肝炎病毒感染者YMDD自然變異研究[J];華南國防醫(yī)學雜志;2005年02期

4 王迎秋;普冬;;HBV YMDD自然變異的臨床分析[J];中國熱帶醫(yī)學;2009年04期

5 汪小娟,劉香萍,羅曉都,葉國強,謝春英,潘春燕;拉米夫定治療乙型肝炎病毒感染中YMDD變異發(fā)生與HBV DNA水平的關系[J];現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志;2004年04期

6 周強;張文;丁海明;梁偉雄;;拉米夫定治療慢性乙型肝炎不同病毒基因型患者的療效[J];廣東醫(yī)學;2006年08期

7 林蓮英;張文;邱峰;;慢性乙型肝炎病毒基因型與YMDD變異關系[J];現(xiàn)代臨床醫(yī)學生物工程學雜志;2006年02期

8 屈軍校;曾慶磊;徐光華;;慢性HBV感染YMDD自然變異的研究進展[J];世界華人消化雜志;2010年09期

9 王硯冰;石銘;;影響乙型肝炎患者HBV YMDD變異的相關因素分析[J];檢驗醫(yī)學與臨床;2007年01期

10 綦盛麟;宋連平;石銘;祝英華;徐永平;;慢性乙型肝炎患者拉米夫定耐藥快速檢測[J];中華實驗和臨床感染病雜志(電子版);2008年03期

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1 湯雄;汪夢;陶冶;;拉米夫定聯(lián)合醫(yī)用臭氧治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎療效及其對乙肝病毒YMDD變異的影響[A];江西省第四次中西醫(yī)結合消化系統(tǒng)疾病學術交流會論文匯編[C];2011年

2 湯雄;汪夢;陶冶;;拉米夫定聯(lián)合醫(yī)用臭氧治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎療效及其對乙肝病毒YMDD變異的影響[A];全國中西醫(yī)結合肝病新進展講習班、江西省第二次中西醫(yī)結合肝病學術會議資料匯編[C];2010年

3 張永華;馮慧;;健脾補腎法抗賀普丁致YMDD變異及免疫學機理探討研究[A];第二十一屆全國中西醫(yī)結合消化系統(tǒng)疾病學術會議暨國家級中西醫(yī)結合消化系統(tǒng)疾病新進展學習班論文匯編[C];2009年

4 張靜;徐維家;王青;;慢性乙型肝炎治療過程中HBV YMDD變異的相關因素分析[A];中華醫(yī)學會第七次全國檢驗醫(yī)學學術會議資料匯編[C];2008年

5 張永華;馮慧;;健脾補腎法抗賀普丁致YMDD變異及免疫學機理探討研究[A];第十八次全國中西醫(yī)結合肝病學術會議論文匯編[C];2009年

6 于韶榮;劉寶瑞;;PNA-PCR/焦測序:一種敏感而簡便的檢測血漿中KRAS突變的方法[A];2010’全國腫瘤分子標志及應用學術研討會暨第五屆中國中青年腫瘤專家論壇論文匯編[C];2010年

7 張永華;韓穎;;健脾補腎法抗賀普丁致YMDD變異及免疫學機理探討研究[A];浙江省中醫(yī)藥學會肝病專業(yè)委員會2009年學術年會暨肝病新進展繼續(xù)教育學習班論文匯編[C];2009年

8 丁昌平;張敏;嚴志剛;楊建國;曹春梅;柳健;;拉米夫定治療慢性乙型肝炎病毒感染中YMDD變異的觀察[A];中華醫(yī)學會第七次全國檢驗醫(yī)學學術會議資料匯編[C];2008年

9 于韶榮;謝麗;魏嘉;禹立霞;劉寶瑞;;高保真酶PNA-PCR/焦磷酸測序法:一種敏感準確的檢測腫瘤患者血漿KRAS基因突變的方法[A];中華醫(yī)學會腫瘤學分會第七屆全國中青年腫瘤學術會議——中華醫(yī)學會腫瘤學分會“中華腫瘤 明日之星”大型評選活動暨中青年委員全國遴選論文匯編[C];2011年

10 寧波;李一粟;馬建珍;魏賢珍;張虎;王新宴;;銅綠假單胞菌感染分布及耐藥變遷[A];第三屆重癥醫(yī)學大會論文匯編[C];2009年

中國重要報紙全文數(shù)據庫 前10條

1 王樂民;濫用抗生素我國常見病原菌耐藥率高[N];大眾衛(wèi)生報;2004年

2 黃薇;我國細菌耐藥率也在上升[N];健康報;2007年

3 萬同己;抗乙肝病毒的聯(lián)合用藥[N];中國醫(yī)藥報;2004年

4 記者 鄭智敏;耐藥率對乙肝治療成本意義重大[N];醫(yī)藥經濟報;2009年

5 記者 王丹;我國抗菌藥物耐藥率居高不下[N];健康報;2010年

6 李建偉;革蘭氏陽性菌耐藥率高[N];健康報;2002年

7 陶錫萍;恩替卡韋耐藥發(fā)生率極低[N];中國醫(yī)藥報;2008年

8 北京大學第一醫(yī)院消化科教授 胡伏蓮;處理Hp感染：解決三大臨床問題[N];健康報;2008年

9 傅俊英;中藥可抑制拉米夫定誘發(fā)的乙肝病毒變異[N];中國醫(yī)藥報;2009年

10 北京地壇醫(yī)院主任醫(yī)師 蔡fg東;抗乙肝病毒 別把耐藥妖魔化[N];健康報;2010年

中國博士學位論文全文數(shù)據庫 前10條

1 石銘;乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥株變異率快速檢測方法的建立及應用研究[D];大連理工大學;2008年

2 焦麗燕;血漿RNA和PBMCs DNA HIV-1耐藥準種多態(tài)性和分子進化研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2011年

3 唐景峰;乙肝病毒耐藥及致癌突變的高靈敏檢測新技術研究[D];武漢大學;2011年

4 吳健;肝移植病人乙型肝炎病毒再感染的臨床和基礎研究[D];浙江大學;2001年

5 孫劍;拉米夫定耐藥患者的臨床特點及耐藥毒株的分子病毒學研究[D];中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學;2003年

6 王明華;qnr介導細菌對喹諾酮類耐藥機制的研究[D];復旦大學;2010年

7 張瑞祺;乙型肝炎病毒基因分析及其與抗病毒療效關系的研究[D];第二軍醫(yī)大學;2002年

8 倪朝輝;產超廣譜β-內酰胺酶革蘭陰性菌分子耐藥機制研究[D];吉林大學;2007年

9 周霞;阿德福韋酯耐藥模式及其免疫選擇特性研究[D];第三軍醫(yī)大學;2012年

10 王悅;泛耐藥鮑曼不動桿菌臨床株W61耐藥與播散機制的基因組學研究[D];天津醫(yī)科大學;2012年

中國碩士學位論文全文數(shù)據庫 前10條

1 張迎迎;利用PNA-PCR法早期檢測乙型病毒性肝炎YMDD耐藥變異[D];南方醫(yī)科大學;2013年

2 鄭慧珂;拉米夫定耐藥的慢乙肝患者救援治療過程中YMDD變異的演化及其對治療療效的影響[D];南方醫(yī)科大學;2012年

3 胡曉武;拉米夫定治療慢性乙型肝炎YMDD變異檢測及分析[D];安徽醫(yī)科大學;2012年

4 王怡;乙肝病毒基因型與拉米夫定所致YMDD變異的相關性研究[D];新疆醫(yī)科大學;2011年

5 吳超飛;拉米夫定耐藥的臨床與病毒學研究[D];南方醫(yī)科大學;2010年

6 景博瓊;拉米夫定聯(lián)合清肝解毒湯對肝郁脾虛型慢性乙型肝炎YMDD變異的影響[D];新疆醫(yī)科大學;2010年

7 白克華;乙型肝炎病毒YMDD變異株的檢測及其臨床意義[D];山西醫(yī)科大學;2004年

8 李春明;HBV YMDD拉米夫定耐藥變異的檢測及臨床治療相關因素的分析[D];新疆醫(yī)科大學;2003年

9 蘭青;人類免疫缺陷病毒/艾滋病合并乙型肝炎病毒感染的研究[D];昆明醫(yī)學院;2011年

10 董莉;阿德福韋酯治療慢性乙型肝炎的療效及相關影響因素的研究[D];南京醫(yī)科大學;2006年

  本文關鍵詞：利用PNA-PCR法早期檢測乙型病毒性肝炎YMDD耐藥變異，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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