發(fā)布時(shí)間：2020-06-10 19:54

【摘要】：實(shí)驗(yàn)背景及目的:間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植對于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種非常有前景的治療策略。然而,移植后細(xì)胞的低滯留率限制了MSCs在IBD治療中的應(yīng)用。在我們以往的實(shí)驗(yàn)中,通過將殼聚糖(chitosan,CS)固定在胰島素樣生長因子-1的C結(jié)構(gòu)域肽(the C domain peptide of insulin-like growth factor-1,IGF-1C)上而合成的一種新型的具有生物活性的水凝膠基質(zhì),它可以通過模擬干細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境來保持干細(xì)胞的活性。因此,我們的研究目的是探討人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(human placenta-derived Mesenchymal stem cells,PMSCs)與殼聚糖-胰島素樣生長因子-1C(CS-IGF-1C)水凝膠通過局部注射的方式,共同移植到受損結(jié)腸,是否可以改善2,4,6-三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)誘導(dǎo)的小鼠的結(jié)腸炎,并闡明其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase,Fluc)和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的PMSCs的細(xì)胞系,利用這種細(xì)胞系,通過生物發(fā)光成像技術(shù)(bioluminescence imaging,BLI)檢測CS-IGF-1C水凝膠對PMSCs的生物相容性,以及體內(nèi)促進(jìn)PMSCs存活的效果。在TNBS灌腸誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎后的第2天,在炎癥部位的腸系膜根部局部注射PBS、CS或CS-IGF-1C水凝膠與PMSCs的混懸液以及不含PMSCs的PBS作為空白對照。經(jīng)小動物活體成像技術(shù)檢測PMSCs在第1、3、5、7天的存活情況和表征炎癥反應(yīng)程度的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的含量,收集腸組織進(jìn)行組織病理學(xué)分析,并通過實(shí)時(shí)PCR(real time PCR)檢測炎性因子的表達(dá)情況。通過蛋白印跡技術(shù)(western blot)和免疫熒光分析檢測移植后腸組織及腹腔巨噬細(xì)胞的表型。通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定不同培養(yǎng)條件下(涂布CS或CS-IGF-1C水凝膠,或未涂布水凝膠的對照組)的PMSCs上清液中前列腺素E-2(prostaglandin,PGE2)的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:BLI結(jié)果表明,與游離的PMSCs或PMSCs/CS組相比,CS-IGF-1C水凝膠可顯著促進(jìn)PMSCs的增殖(p0.05)。此外,小動物活體成像結(jié)果證實(shí),CS-IGF-1C水凝膠可顯著促進(jìn)移植后PMSCs在體內(nèi)的存活(p0.05)。與此同時(shí),CS-IGF-1C水凝膠與PMSCs共移植可顯著改善小鼠結(jié)腸炎,增加體重,下調(diào)促炎因子的表達(dá),并降低ROS的含量(p0.05),減輕腸道炎癥,改善組織學(xué)特征。此外,ELISA結(jié)果顯示CS-IGF-1C水凝膠能夠促進(jìn)PMSCs對PGE2的釋放(p0.05)。從免疫熒光分析結(jié)果得出CS-IGF-1C水凝膠能夠促進(jìn)PMSCs對M2巨噬細(xì)胞的極化同時(shí)伴隨白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)的表達(dá),并進(jìn)一步降低M1巨噬細(xì)胞的水平(p0.05)。結(jié)論:局部應(yīng)用CS-IGF-1C水凝膠包被的PMSCs可通過促進(jìn)這些供體細(xì)胞釋放PGE2,以極化M2巨噬細(xì)胞并伴隨IL-10的上調(diào),從而顯著減輕小鼠結(jié)腸炎。
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析二、結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析2.1 PMSCs 的特性2.1.1 PMSCs 的增殖能力及轉(zhuǎn)染率我們對 P4 代的 PMSCs 進(jìn)行慢病毒的轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染后的 PMSCs 進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)并計(jì)數(shù)，擴(kuò)增基數(shù)為 106，培養(yǎng)第 2 - 3 天后細(xì)胞達(dá) 90%以上融合度，消化計(jì)數(shù)傳代，依此循環(huán)，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的 PMSCs 具有非常強(qiáng)的增殖能力，且其增殖曲線成指數(shù)型。流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，GFP 陽性的細(xì)胞的數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)量的 90.4%，即 PMSCs 的轉(zhuǎn)染率為 90.4%。

（造血系干細(xì)胞標(biāo)志）以及 CD31（內(nèi)皮標(biāo)志）的表達(dá)率分別為 1.04%和 2.37%。由此我們可以看出轉(zhuǎn)染后的 PMSCs 仍然保持典型間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)。圖1.3 轉(zhuǎn)染后PMSCs體外表征。A: 油紅O染色 (I)；茜素紅S染色 (II)；甲苯胺藍(lán)染色 (III)。標(biāo)尺=200 μm；B：P6 代 PMSCs 流式分析。2.1.4 PMSCs 體內(nèi)示蹤的條件為了在活體動物體內(nèi)觀察到存活的 PMSCs，我們將細(xì)胞轉(zhuǎn)染了 GFP-Fluc 基因，GFP 的表達(dá)前文已述。我們將細(xì)胞按數(shù)量梯度接種到六孔板，加入螢火蟲熒光素酶的底物 D-luciferin 后，放在小動物活體成像系統(tǒng)的暗箱內(nèi)進(jìn)行成像，，我
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R574.62

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本文編號：2706782