【摘要】：目的： 1.獲得土撥鼠PD-L1和PD-L2分子的序列,表達(dá)蛋白胞外段,制備并鑒定相應(yīng)的兔源性多克隆抗體。 2.探索不同TLR通路的激活對肝細(xì)胞和淋巴細(xì)胞亞群表面抑制性分子表達(dá)水平的影響。評估PD-1、PD-L1、PD-L2分子在土撥鼠肝炎模型中與疾病進(jìn)展之間的關(guān)系。 3.探討在土撥鼠慢性肝炎模型中,能否通過阻斷PD-1/PD-L通路,有效恢復(fù)T細(xì)胞功能,控制病毒感染,為研制和開發(fā)有效的乙肝治療手段提供實驗依據(jù)。 方法： 1.從慢性土撥鼠肝炎病毒(WHV)感染的土撥鼠肝組織RNA中克隆PD-L1和PD-L2的cDNA序列,測序并分析wPD-L1/-L2和其它哺乳動物相應(yīng)分子的核苷酸、氨基酸同源性。 2.從正常土撥鼠分離土撥鼠原代肝細(xì)胞(PWH)和外周血單個核細(xì)胞(PBMC),經(jīng)Toll樣受體(TLR)的配體及干擾素(IFN)刺激后熒光實時定量PCR(real time PCR)和流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分別檢測PD-L1 RNA水平和蛋白水平的表達(dá)。分析PBMCs中各種細(xì)胞亞群對TLR和IFN刺激的反應(yīng)性。 3.從不同WHV感染狀態(tài)(未感染、急性感染、慢性感染)的土撥鼠肝組織中分離總RNA,real time PCR檢測PD-L1分子RNA水平。 4.在不同WHV感染時間點(未感染、急性感染早期、急性感染晚期、慢性感染)的土撥鼠中分離PBMC, FACS檢測并分析不同細(xì)胞亞群(CD4和CD8細(xì)胞)PD-1和PD-L1分子的表達(dá)水平。 5.原核表達(dá)并純化wPD-L1/-L2的胞外段,免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗血清并純化得到多克隆抗體。用ELISA法檢測抗體的效價。構(gòu)建表達(dá)wPD-L1全長和wPD-L2胞外區(qū)及跨膜區(qū)的真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)后收集培養(yǎng)細(xì)胞,用Western blot和免疫熒光鑒定抗體的結(jié)合力和特異性。 6.在不同WHV感染時間點(未感染、急性感染早期、急性感染晚期、慢性感染)的土撥鼠中分離PBMC,用wPD-L1/-L2多抗體外阻斷PD-1/PD-Ls通路,分別用[2-3H]法和FACS檢測抗原特異性的T細(xì)胞的增殖和殺傷功能。 結(jié)果： 1.獲得wPD-L1和wPD-L2分子編碼區(qū)(CDS)序列。wPD-L1基因CDS全長為864bp,與人、豬、小鼠、牛的核酸同源性分別為84.9%、82.1%、75.3%、80.9%,蛋白同源性為75.9%、71.9%、66.2%、70.4%；wPD-L2全長822bp,與人、猴、豬、小鼠核酸同源性分別為83.8%、83.2%、80.3%、78.0%,蛋白同源性為72.9%、72.5%、68.8%、70.9%,wPD-L1與wPD-L2同源性為31.4%。 2.PWH和PBMC的wPD-L1基礎(chǔ)表達(dá)水平較低,經(jīng)TLR配體及IFN刺激后,wPD-L1 RNA水平和蛋白水平的表達(dá)誘導(dǎo)性上調(diào)。其中,TLR1/2、3、4、7、IFN-α、IFN-γ對PWH上調(diào)作用明顯,其他配體無明顯刺激作用。TLR4、7對PBMC上調(diào)作用較強(qiáng),TLR1/2、3、IFN-α、IFN-γ作用較弱,TLR2/6、5、9的作用不穩(wěn)定。CD4-細(xì)胞對TLR和IFN刺激的反應(yīng)強(qiáng)于CD4+細(xì)胞。 3.正常土撥鼠肝組織內(nèi)wPD-L1 RNA表達(dá)水平明顯高于PWH,在急、慢性感染動物肝組織中略有上調(diào),在HDV/WHV重疊感染中,肝內(nèi)wPD-L1水平顯著升高。 4.與肝組織內(nèi)不同,慢性WHV感染中,PBMC的wPD-1和wPD-L1表達(dá)明顯高于正常水平。在急性感染中,wPD-1和,wPD-L1表達(dá)水平上調(diào),wPD-1于急性感染早期表達(dá)較高,而wPD-L1于急性晚期表達(dá)較高。 5.構(gòu)建WPD-L1/-L2的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-wL1和pET30a-wL2,轉(zhuǎn)化BL21(DE3)plyS表達(dá)菌,經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組His-wPD-L1和His-wPD-L2胞外區(qū)蛋白。用鎳柱純化濃縮后,免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗血清。通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測到抗血清效價大于1：100萬,用SPA柱吸附純化血清得到多克隆抗體(IgG)。 6.用瞬時轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒獲得的wPD-L1/-L2檢測抗體,多抗Western blot效價均約為1：2000,免疫熒光(IF)效價分別為1：100(抗wPD-L1)和1：200(抗wPD-L2)。 7.在部分急、慢性感染的土撥鼠的PBMC中,阻斷wPD-L1可以上調(diào)抗原特異性T細(xì)胞的增殖和殺傷功能,阻斷wPD-L2僅在少數(shù)動物中促進(jìn)特異性T細(xì)胞增殖,而對殺傷功能無明顯影響。 結(jié)論： 1.成功獲得土撥鼠PD-L1/-L2的全長序列。 2.TLR配體和IFN對PWH和PBMC上PD-L1分子具有上調(diào)作用。PD-L1的這種誘導(dǎo)性表達(dá)與肝炎病毒感染中天然免疫系統(tǒng)的激活相關(guān)。急、慢性感染中PBMC表達(dá)PD-1/PD-L1分子明顯上調(diào),與感染過程中T細(xì)胞功能變化有關(guān)。 3.肝細(xì)胞并非肝內(nèi)PD-L1的主要來源。在感染過程中肝臟總體PD-L1的變化不明顯,這與肝臟本身的免疫耐受功能有關(guān)。 4.制備了特異性的wPD-L1/-L2多克隆抗體,用于檢測wPD-L1/-L2在組織或細(xì)胞中的表達(dá)情況。該抗體體外阻斷PD-1/PD-L1通路后,能在部分動物中有效促進(jìn)特異性T細(xì)胞增殖和脫顆粒功能。 5.體外阻斷實驗在部分動物中不能發(fā)揮作用,表明參與T細(xì)胞功能抑制是一個多因素的復(fù)雜系統(tǒng),單純阻斷PD-1/PD-L1通路不能適用于所有個體,可能需要聯(lián)合多種治療才能達(dá)到有效的治療效果。 本研究的創(chuàng)新點及意義： 1.系統(tǒng)研究了TLR信號和IFN對PWH和PBMC細(xì)胞不同亞群表面PD-L1分子表達(dá)的影響,為研究特異性T細(xì)胞應(yīng)答與天然免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系提供了實驗依據(jù)。 2.在土撥鼠嗜肝病毒感染模型中研究了不同病毒感染狀態(tài)下抑制性信號通路PD-1/PD-L1的表達(dá)和變化情況,為HBV的發(fā)病機(jī)理和慢性化的免疫機(jī)制提供了參考。 3.利用純化wPD-L1/PD-L2蛋白制備多克隆抗體,體外阻斷PD-1/PD-L1通路能夠部分重建特異性T細(xì)胞應(yīng)答,為以后的體內(nèi)阻斷實驗提供依據(jù),并提出了該阻斷方法的缺點和可能的優(yōu)化措施。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R575.1

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本文編號：2706638