【摘要】：目的： 1.獲得土撥鼠PD-L1和PD-L2分子的序列,表達蛋白胞外段,制備并鑒定相應的兔源性多克隆抗體。 2.探索不同TLR通路的激活對肝細胞和淋巴細胞亞群表面抑制性分子表達水平的影響。評估PD-1、PD-L1、PD-L2分子在土撥鼠肝炎模型中與疾病進展之間的關(guān)系。 3.探討在土撥鼠慢性肝炎模型中,能否通過阻斷PD-1/PD-L通路,有效恢復T細胞功能,控制病毒感染,為研制和開發(fā)有效的乙肝治療手段提供實驗依據(jù)。 方法： 1.從慢性土撥鼠肝炎病毒(WHV)感染的土撥鼠肝組織RNA中克隆PD-L1和PD-L2的cDNA序列,測序并分析wPD-L1/-L2和其它哺乳動物相應分子的核苷酸、氨基酸同源性。 2.從正常土撥鼠分離土撥鼠原代肝細胞(PWH)和外周血單個核細胞(PBMC),經(jīng)Toll樣受體(TLR)的配體及干擾素(IFN)刺激后熒光實時定量PCR(real time PCR)和流式細胞術(shù)(FACS)分別檢測PD-L1 RNA水平和蛋白水平的表達。分析PBMCs中各種細胞亞群對TLR和IFN刺激的反應性。 3.從不同WHV感染狀態(tài)(未感染、急性感染、慢性感染)的土撥鼠肝組織中分離總RNA,real time PCR檢測PD-L1分子RNA水平。 4.在不同WHV感染時間點(未感染、急性感染早期、急性感染晚期、慢性感染)的土撥鼠中分離PBMC, FACS檢測并分析不同細胞亞群(CD4和CD8細胞)PD-1和PD-L1分子的表達水平。 5.原核表達并純化wPD-L1/-L2的胞外段,免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗血清并純化得到多克隆抗體。用ELISA法檢測抗體的效價。構(gòu)建表達wPD-L1全長和wPD-L2胞外區(qū)及跨膜區(qū)的真核表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染幼倉鼠腎細胞(BHK)后收集培養(yǎng)細胞,用Western blot和免疫熒光鑒定抗體的結(jié)合力和特異性。 6.在不同WHV感染時間點(未感染、急性感染早期、急性感染晚期、慢性感染)的土撥鼠中分離PBMC,用wPD-L1/-L2多抗體外阻斷PD-1/PD-Ls通路,分別用[2-3H]法和FACS檢測抗原特異性的T細胞的增殖和殺傷功能。 結(jié)果： 1.獲得wPD-L1和wPD-L2分子編碼區(qū)(CDS)序列。wPD-L1基因CDS全長為864bp,與人、豬、小鼠、牛的核酸同源性分別為84.9%、82.1%、75.3%、80.9%,蛋白同源性為75.9%、71.9%、66.2%、70.4%；wPD-L2全長822bp,與人、猴、豬、小鼠核酸同源性分別為83.8%、83.2%、80.3%、78.0%,蛋白同源性為72.9%、72.5%、68.8%、70.9%,wPD-L1與wPD-L2同源性為31.4%。 2.PWH和PBMC的wPD-L1基礎表達水平較低,經(jīng)TLR配體及IFN刺激后,wPD-L1 RNA水平和蛋白水平的表達誘導性上調(diào)。其中,TLR1/2、3、4、7、IFN-α、IFN-γ對PWH上調(diào)作用明顯,其他配體無明顯刺激作用。TLR4、7對PBMC上調(diào)作用較強,TLR1/2、3、IFN-α、IFN-γ作用較弱,TLR2/6、5、9的作用不穩(wěn)定。CD4-細胞對TLR和IFN刺激的反應強于CD4+細胞。 3.正常土撥鼠肝組織內(nèi)wPD-L1 RNA表達水平明顯高于PWH,在急、慢性感染動物肝組織中略有上調(diào),在HDV/WHV重疊感染中,肝內(nèi)wPD-L1水平顯著升高。 4.與肝組織內(nèi)不同,慢性WHV感染中,PBMC的wPD-1和wPD-L1表達明顯高于正常水平。在急性感染中,wPD-1和,wPD-L1表達水平上調(diào),wPD-1于急性感染早期表達較高,而wPD-L1于急性晚期表達較高。 5.構(gòu)建WPD-L1/-L2的原核表達質(zhì)粒pET28a-wL1和pET30a-wL2,轉(zhuǎn)化BL21(DE3)plyS表達菌,經(jīng)過IPTG誘導表達獲得重組His-wPD-L1和His-wPD-L2胞外區(qū)蛋白。用鎳柱純化濃縮后,免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗血清。通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測到抗血清效價大于1：100萬,用SPA柱吸附純化血清得到多克隆抗體(IgG)。 6.用瞬時轉(zhuǎn)染真核表達質(zhì)粒獲得的wPD-L1/-L2檢測抗體,多抗Western blot效價均約為1：2000,免疫熒光(IF)效價分別為1：100(抗wPD-L1)和1：200(抗wPD-L2)。 7.在部分急、慢性感染的土撥鼠的PBMC中,阻斷wPD-L1可以上調(diào)抗原特異性T細胞的增殖和殺傷功能,阻斷wPD-L2僅在少數(shù)動物中促進特異性T細胞增殖,而對殺傷功能無明顯影響。 結(jié)論： 1.成功獲得土撥鼠PD-L1/-L2的全長序列。 2.TLR配體和IFN對PWH和PBMC上PD-L1分子具有上調(diào)作用。PD-L1的這種誘導性表達與肝炎病毒感染中天然免疫系統(tǒng)的激活相關(guān)。急、慢性感染中PBMC表達PD-1/PD-L1分子明顯上調(diào),與感染過程中T細胞功能變化有關(guān)。 3.肝細胞并非肝內(nèi)PD-L1的主要來源。在感染過程中肝臟總體PD-L1的變化不明顯,這與肝臟本身的免疫耐受功能有關(guān)。 4.制備了特異性的wPD-L1/-L2多克隆抗體,用于檢測wPD-L1/-L2在組織或細胞中的表達情況。該抗體體外阻斷PD-1/PD-L1通路后,能在部分動物中有效促進特異性T細胞增殖和脫顆粒功能。 5.體外阻斷實驗在部分動物中不能發(fā)揮作用,表明參與T細胞功能抑制是一個多因素的復雜系統(tǒng),單純阻斷PD-1/PD-L1通路不能適用于所有個體,可能需要聯(lián)合多種治療才能達到有效的治療效果。 本研究的創(chuàng)新點及意義： 1.系統(tǒng)研究了TLR信號和IFN對PWH和PBMC細胞不同亞群表面PD-L1分子表達的影響,為研究特異性T細胞應答與天然免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系提供了實驗依據(jù)。 2.在土撥鼠嗜肝病毒感染模型中研究了不同病毒感染狀態(tài)下抑制性信號通路PD-1/PD-L1的表達和變化情況,為HBV的發(fā)病機理和慢性化的免疫機制提供了參考。 3.利用純化wPD-L1/PD-L2蛋白制備多克隆抗體,體外阻斷PD-1/PD-L1通路能夠部分重建特異性T細胞應答,為以后的體內(nèi)阻斷實驗提供依據(jù),并提出了該阻斷方法的缺點和可能的優(yōu)化措施。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R575.1

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本文編號：2706638