【摘要】：目的食管壁內(nèi)神經(jīng)元減少是導(dǎo)致賁門失弛緩癥患者食管動力障礙的主要機制,但其原因不明。我們通過分析嗜酸性粒細(xì)胞在賁門失弛緩癥患者食管肌層的分布以及與食管壁內(nèi)神經(jīng)元表達的相關(guān)性,研究嗜酸性粒細(xì)胞在動物實驗及體外實驗中對食管壁內(nèi)神經(jīng)元的損傷作用及機制,探討抗嗜酸性粒細(xì)胞藥物對賁門失弛緩癥的治療作用。方法(1)納入于我院就診并經(jīng)胃鏡、鋇餐及食管測壓等確診為賁門失弛緩癥并接受POEM治療的28名患者作為賁門失弛緩癥組,同時選取行外科食管切除術(shù)的食管癌患者9例作為對照組。實驗組標(biāo)本取自POEM術(shù)中粘膜下隧道建立后,分別活檢食管LES部位、LES上方5cm及LES上方10cm部位(遠(yuǎn)段、中段及近段食管)的環(huán)形肌組織。對照組標(biāo)本取自正常食管組織肌條,同樣于術(shù)中選取與賁門失弛緩癥患者取材部位相對應(yīng)的食管體部近段、中段及遠(yuǎn)段的肌層組織。所有標(biāo)本均行HE染色觀察食管肌層組織的嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)及分布,并比較不同部位之間計數(shù)及分布的差異。行免疫組化觀察嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)、嗜酸性粒細(xì)胞來源神經(jīng)毒素(EDN)、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子以及食管壁內(nèi)神經(jīng)元的分布。分析賁門失弛緩癥患者食管肌層嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)與臨床數(shù)據(jù)的關(guān)系。(2)取Balb/c小鼠20只,分為模型制作組及正常對照組。通過OVA致敏的方式制作嗜酸性粒細(xì)胞浸潤食管肌層的動物模型,行高分辨率食管測壓及食管排空檢查觀察模型組小鼠與對照組小鼠食管運動功能的差異,行HE觀察兩組小鼠食管肌層嗜酸性粒細(xì)胞浸潤程度,行免疫組化觀察兩組小鼠食管ECP、EDN、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子以及食管壁內(nèi)神經(jīng)元的表達。另取60只Balb/c小鼠,隨機分為OVA處理實驗組和對照組,分別于實驗前、實驗第20天、28天、35天、50天及75天通過高分辨率食管測壓及食管排空檢查檢測食管運動功能的變化,通過HE染色觀察食管不同部位嗜酸性粒細(xì)胞聚集的情況,通過免疫組化觀察食管ECP、EDN、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子以及食管壁內(nèi)神經(jīng)元的表達。(3)取健康小鼠5只,分離嗜酸性粒細(xì)胞及食管腸神經(jīng)元細(xì)胞進行體外培養(yǎng),嗜酸性粒細(xì)胞與腸神經(jīng)元共培養(yǎng)組為實驗組,在腸神經(jīng)元細(xì)胞中加入提純的ECP為干預(yù)組,單純培養(yǎng)的腸神經(jīng)元細(xì)胞作為對照組,通過MTT法觀察共培養(yǎng)不同時間嗜酸性粒細(xì)胞及ECP對腸神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響,通過流式細(xì)胞檢測嗜酸性粒細(xì)胞及ECP處理的腸神經(jīng)元細(xì)胞死亡的百分比。進一步分離嗜酸性粒細(xì)胞浸潤食管肌層的動物離體食管平滑肌條,取健康小鼠離體食管平滑肌條作為對照組,置入裝有Krebs液的恒溫平滑肌槽中,部分對照組Krebs液中加入嗜酸性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清液,生物機能實驗系統(tǒng)記錄電刺激下肌條收縮的幅度及變化。(4)取Blab/c小鼠40只,隨機分為4組,OVA模型組,Siglect抗體藥物干預(yù)組,CCR3單抗藥物干預(yù)組以及健康對照組。通過高分辨率食管測壓及食管排空檢查觀察不同組小鼠實驗前后食管運動功能的改變及差異,通過HE染色觀察實驗前后不同組小鼠食管嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)的變化及差異,通過免疫組化染色觀察實驗前后不同組小鼠食管ECP、EDN以及食管壁內(nèi)神經(jīng)元的分布及變化。結(jié)果(1)與對照組相比,賁門失弛緩癥患者食管肌層不同部位嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)及分布均明顯增多(P0.05),不同部位食管肌層嗜酸性粒細(xì)胞浸潤無明顯差異(P0.05)。賁門失弛緩癥患者食管肌層ECP、EDN及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子可見不同程度的分布,食管壁內(nèi)神經(jīng)明顯減少或消失,對照組食管組織中未見明顯ECP、EDN及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的表達,食管壁內(nèi)神經(jīng)元未見明顯病理改變。賁門失弛緩癥食管肌層嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量與POEM術(shù)后1年的Eckardt評分有相關(guān)性。(2)通過高分辨率食管測壓結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組小鼠食管LES部位壓力明顯增高(P0.05)。通過食管排空檢查結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組小鼠食管體部排空時間及食管排空通過賁門的時間均明顯延長(P0.05)。HE染色及免疫組化結(jié)果顯示,模型組小鼠食管肌層有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤,ECP、EDN呈陽性表達,食管壁內(nèi)神經(jīng)元明顯減少或消失。且不同時段的食管測壓及食管排空檢查顯示,食管LES部位壓力及食管排空時間隨著造模時間的延長,均逐步增加。HE及免疫組化結(jié)果表明,隨著食管肌層嗜酸性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量的增加,食管壁內(nèi)神經(jīng)元的表達逐漸減少或消失。(3)正常培養(yǎng)的腸神經(jīng)元細(xì)胞3天后的死亡率為8.41%,與嗜酸性粒細(xì)胞共培養(yǎng)的腸神經(jīng)元細(xì)胞死亡率為51.2%,在正常培養(yǎng)的腸神經(jīng)元細(xì)胞中添加ECP蛋白后,神經(jīng)元的死亡率增加至62.2%,三組數(shù)據(jù)之間差異有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。與正常培養(yǎng)的腸神經(jīng)元相比,與嗜酸性粒細(xì)胞共培養(yǎng)以及加入重組ECP蛋白組的腸神經(jīng)元活性在24h及48h均有明顯下降(P0.05)。在一定參數(shù)電刺激下,模型組小鼠食管平滑肌條收縮幅度與健康對照小鼠對比,幅度明顯降低(P0.05)。干預(yù)組與健康對照組未見顯著差異(P0.05)。(4)通過抗嗜酸性粒細(xì)胞藥物干預(yù)后,通過高分辨率食管測壓以及食管排空檢查觀察模型組小鼠LES部位壓力及食管排空時間與Siglect抗體藥物干預(yù)組、CCR3單抗藥物干預(yù)組以及健康對照組小鼠相比,均明顯增加。HE染色及免疫組化結(jié)果顯示,模型組小鼠食管肌層有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤,ECP、EDN呈陽性表達,食管壁內(nèi)神經(jīng)元明顯減少或消失。而其他三組小鼠食管肌層未見明顯炎性物質(zhì)的表達,食管壁內(nèi)神經(jīng)元未見明顯變化。結(jié)論賁門失弛緩癥患者食管肌層有不同程度嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤,且與POEM術(shù)后療效相關(guān);通過OVA可以制作嗜酸性粒細(xì)胞浸潤食管肌層的動物模型,且嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤與食管壁內(nèi)神經(jīng)元的減少有關(guān)并影響食管運動功能;體外培養(yǎng)的嗜酸性粒細(xì)胞可以損傷腸神經(jīng)元細(xì)胞,且改變離體食管平滑肌的收縮功能;抗嗜酸性粒細(xì)胞藥物可以改善賁門失弛緩癥動物模型的食管運動功能,減少食管壁內(nèi)神經(jīng)元的損傷。
【圖文】：

歲 51.1±14.5 (24 78) 60.8±9.6 (45 75病程，月 28.0±18.4 (5 80) -芝加哥分型 (I /II / III) 12/14/2 -POEM 術(shù)前 Eckardt 評分 8.1±1.6 (5 12) -POEM 術(shù)后 1 年 Eckardt 評分 2.3±1.3 (0 4) -1.2.2 活化的嗜酸性粒細(xì)胞在食管不同部位的分布HE 染色鏡檢顯示 28 例賁門失弛緩癥患者中，有 24 例（85.7%）患者食管肌層發(fā)現(xiàn)不同程度的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，表現(xiàn)為近短食管、中段食管及遠(yuǎn)段食管肌層組織可見不同程度的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，其中有 8 例（28.6%）賁門失弛緩癥患者食管肌層每高倍鏡下可見 15 個以上的嗜酸性粒細(xì)胞，呈彌漫或多灶性分布，部分可伴有少量淋巴細(xì)胞浸潤。食管黏膜層中均未發(fā)現(xiàn)有嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。9 例對照組 HE 染色鏡檢僅有 1 例顯示輕微炎癥變化，其余均未見嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤（圖 1）。

圖 2 賁門失弛緩癥及對照組食管嗜酸性粒細(xì)胞炎性物質(zhì)及食管壁內(nèi)神經(jīng)元的表達（免疫組化：40×）a：賁門失弛緩癥患者食管 ECP 免疫組化染色；b：賁門失弛緩癥患者食管 EDN 免疫組化染色；c & d：賁門失弛緩癥患者食管 S100 免疫組化染色；e：正常對照組食管 ECP 免疫組化染色；f：正常對照組食管 EDN 免疫組化染色；g & h：正常對照組食管 S100 免疫組化染色。1.2.4 嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子在賁門失弛緩癥食管肌層的表達在 28 例賁門失弛緩癥患者的食管組織中，，有 18 例（64.3%）的患者在食管肌層發(fā)現(xiàn)有嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-3（eotaxin-3）的表達，賁門失弛緩癥的食管黏膜層以及對照組的食管全層中均未發(fā)現(xiàn)有嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-3 的陽性表達（圖 3）。a b
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R571

【參考文獻】

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1 徐曉s

本文編號：2706366