【摘要】： 研究背景 脂肪肝已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國(guó)家和富裕地區(qū)慢性肝病的首要病因,在我國(guó)是僅次于乙肝病毒的第二位慢性肝病的原因,嚴(yán)重影響國(guó)民的健康水平及生活質(zhì)量,因此,有關(guān)脂肪肝的研究始終是一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。法尼醇X受體(farnesoid X receptor,FXR)、小異二聚體伴侶分子(small heterodimer partner,SHP)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein-1c, SREBP-1c)屬于核受體或核轉(zhuǎn)錄因子,其中初級(jí)膽酸是FXR的天然激動(dòng)劑。FXR廣泛參與膽汁酸、糖及脂代謝,有可能成為治療脂肪肝和代謝性疾病的新的靶點(diǎn);SHP在膽汁酸、糖、脂代謝中也具有重要作用,是脂肪肝發(fā)病中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子; SREBP-1c參與脂肪生成基因表達(dá)的調(diào)控;其中SHP是FXR的靶基因,SREBP-1c是SHP的靶基因。本實(shí)驗(yàn)采用油酸鈉誘導(dǎo)人正常肝細(xì)胞珠L(zhǎng)02細(xì)胞建立脂肪變肝細(xì)胞模型、采用FXR激動(dòng)劑鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)鈉鹽建立干預(yù)模型,動(dòng)態(tài)觀察肝細(xì)胞脂變過(guò)程中FXR、SHP及SREBP-1c表達(dá)的變化,從肝細(xì)胞水平探討非酒精性脂肪肝脂質(zhì)沉積的可能機(jī)制,為尋找新的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 1、人肝細(xì)胞株L02用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)、傳代。 2、MTT比色法篩選油酸鈉最佳作用濃度和作用時(shí)間。 3、實(shí)驗(yàn)設(shè)立對(duì)照組(記為C組)、模型組(加油酸鈉,記為F組)和干預(yù)組(模型中加入鵝去氧膽酸鈉【1】,記為F1組)。 4、細(xì)胞內(nèi)TG含量檢測(cè)及油紅O染色鑒定L02肝細(xì)胞脂肪變變化;細(xì)胞培養(yǎng)上清ALT、AST含量鑒定細(xì)胞損傷變化;RT-PCR、Western Blot檢測(cè)FXR、SHP、SREBP-1c受體mRNA及蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果 1、L02肝細(xì)胞的脂肪變模型建立成功。隨著造模時(shí)間延長(zhǎng),肝細(xì)胞脂肪變程度加重。 1)油紅O染色:對(duì)照組僅見(jiàn)少量橘紅色脂滴;脂變和干預(yù)組肝細(xì)胞內(nèi)各時(shí)間段都可見(jiàn)明顯脂滴,并有不同程度的融合,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)加重;但是,干預(yù)組的肝細(xì)胞內(nèi)脂滴較脂變組有所減少(P0.01)。 2)脂變組TG含量在24、48、72h各時(shí)間段均比對(duì)照組明顯增加(P0.01);與脂變組相比,干預(yù)組TG含量在24、48、72h時(shí)相應(yīng)時(shí)間段均明顯降低(P0.01)。 2、各組細(xì)胞培養(yǎng)上清ALT、AST變化僅脂變組72小時(shí)AST、ALT水平略有升高,各組均無(wú)明顯差異(P0.05)。 3、各組細(xì)胞內(nèi)FXR、SHP、SREBP-1 c mRNA及蛋白表達(dá)的變化與對(duì)照組比較,脂變組各時(shí)間段的FXRmRNA及蛋白表達(dá)均有所下調(diào),但這種差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而SHP、SREBP-1c mRNA及蛋白表達(dá)明顯上調(diào),并隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)更明顯(P0.01)。在干預(yù)組,FXRmRNA及蛋白的表達(dá)較脂變組和對(duì)照組明顯升高,各時(shí)間點(diǎn)比較都具有顯著性差異(P0.01);SHPmRNA及蛋白表達(dá)同步升高(P0.01);SREBP-1c mRNA及蛋白雖然比對(duì)照組明顯上調(diào)(P0.01),但是與脂變組相比顯著降低(P0.01)。 結(jié)論 1、FXR表達(dá)下調(diào)與肝細(xì)胞脂肪沉積密切相關(guān); 2、促進(jìn)FXR表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)SHP的水平、抑制其靶基因SREBP-1c表達(dá)而改善L02細(xì)胞脂肪變性; 3、SHP在L02細(xì)胞脂肪變性中可能具有雙向調(diào)節(jié)作用; 4、FXR有可能成為治療脂肪肝的新靶點(diǎn),FXR激動(dòng)劑鵝去氧膽酸鈉具有明顯改善肝細(xì)胞脂肪變性的作用。
【圖文】：

37附圖 1 油紅 O 染色觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化（x400）Figure 1 The accumulation of lipid droplets in the hepatocytes was observed by opticalmicroscopy（x400） after with oil red O staining.A 正常對(duì)照組(A1:24h,A2:48h,A3:72h)；B 脂肪變組，24 小時(shí)；C 干預(yù)組，24 小時(shí)； D 脂肪變組，48 小時(shí)；E 干預(yù)組，48 小時(shí)；F 脂肪變組，72 小時(shí)；G 干預(yù)組，72 小時(shí)。A control(A1:24h,A2:48h,A3:72 hour)；B steatosis model，24 hour；C intervention model，24 hour；D steatosis model，48 hour；E intervention model，48 hour；F steatosis model，72 hour；Gintervention model，72 hour。

附圖 2 各組 FXR、SHP、SREBP-1c 蛋白的表達(dá)Figure 2 Expressio of protein of FXR,SHP and SREBP-1c in each groupA 正常對(duì)照組；B 脂肪變組，24 小時(shí)；C 干預(yù)組，24 小時(shí)； D 脂肪變組，48 小時(shí)；E 干預(yù)組，48 小時(shí)；F 脂肪變組，72 小時(shí)；G 干預(yù)組，72 小時(shí)。A control，24 hour；B steatosis model，24 hour；C intervention model，，24 hour；D steatosis model，48 hour；E intervention model，48 hour；F steatosis model，72 hour；G intervention model，72hour。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R575.5

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本文編號(hào)：2706316