【摘要】：【目的】法尼醇X受體(farnesoid X receptor,FXR)又稱作膽汁酸受體,在糖脂代謝中起著重要作用,FXR敲除可以導(dǎo)致小鼠肝脂肪變性,但機(jī)制并不十分清楚。本研究擬探討FXR作為膽汁酸核受體轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控肝脂質(zhì)代謝的分子機(jī)制�！痉椒ā�1)利用高脂飼料和普通飼料分別喂養(yǎng)FXR敲除(FXR~(-/-))小鼠和C57BL/6J野生型小鼠,構(gòu)建非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型,第71天和80天分別測定小鼠葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)和胰島素敏感性,90天后處死,分別采用Western blot、q RT-PCR和免疫組化檢測小鼠肝臟丙酮酸脫氫酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase,PDK4)表達(dá)情況;HE和油紅O染色觀察小鼠肝臟形態(tài)學(xué)變化及脂滴情況;全自動生化分析儀檢測各組小鼠血脂和肝酶類水平。2)動物水平通過腹腔注射DCA(PDKs的抑制劑)同時加高脂飲食喂養(yǎng)FXR~(-/-)小鼠,第4周測定小鼠葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn),第5周處死動物,取相同部位肝臟組織進(jìn)行HE和油紅O染色,觀察小鼠肝臟形態(tài)學(xué)變化及脂滴聚集情況;全自動生化分析儀檢測各組小鼠血脂和肝酶類水平,Western blot檢測肝臟脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶類表達(dá)情況。3)利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建FXR基因敲除肝LO-2細(xì)胞系,Western blot檢測FXR缺失的LO-2細(xì)胞系中PDK4表達(dá)水平,用油酸鈉/棕櫚酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞構(gòu)建高脂環(huán)境,通過BODIPY試劑檢測細(xì)胞脂滴聚集情況�！窘Y(jié)果】1)與WT小鼠體重比較,普通飲食情況,FXR~(-/-)小鼠體重比無差異,高脂飲食,FXR~(-/-)小鼠體重(39.46±3.23g)與WT小鼠體重(50.72±2.16g)相比明顯減輕,體重增長緩慢甚至下降。FXR~(-/-)小鼠肝臟增大(普通飲食喂養(yǎng)時是WT的1.24倍,高脂飲食則是WT的2倍),肝臟表面偏韌,出現(xiàn)凹凸不平的褶狀,色澤偏淡,切面略帶油膩感,高脂誘導(dǎo)會加重其病理狀態(tài)。HE和油紅O染色發(fā)現(xiàn)FXR~(-/-)小鼠肝臟出現(xiàn)空泡化,脂滴聚集,高脂誘導(dǎo)會使肝臟空泡增大,脂滴聚集加重。FXR缺失還會引起小鼠血清中TG、NAFA、LDL水平顯著升高,HDL降低,ALT、AST、ALP升高,提示FXR基因缺失導(dǎo)致小鼠血脂升高,肝臟脂代謝紊亂,最終引起肝損傷。RNA-seq檢測普通飲食喂養(yǎng)時FXR~(-/-)小鼠肝臟各基因表達(dá)水平,與WT小鼠肝臟比較發(fā)現(xiàn)FXR~(-/-)小鼠肝臟的PDK4表達(dá)升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,Western blot、免疫組化和q RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了此結(jié)果,而高脂飲食下,FXR~(-/-)小鼠肝臟中的PDK4表達(dá)升高差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2)腹腔注射DCA后能改善FXR~(-/-)小鼠飲食和體重情況、降低肝臟/體重和腹部脂肪/體重比,改善葡萄糖水平,降低血清中LDL水平,減少肝臟脂滴聚集。Western blot檢測小鼠肝臟組織中脂質(zhì)和甘油三酯合成關(guān)鍵蛋白酶,發(fā)現(xiàn)DCA能促進(jìn)FASN和ACC的表達(dá),降低ACLY的表達(dá);同時降低脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白酶如HSL、PPARα和PPARγ的表達(dá);FXR缺失會導(dǎo)致m TOR水平增加,而DCA可能通過抑制m TOR表達(dá)來調(diào)控肝脂質(zhì)代謝。3)FXR敲除的LO-2細(xì)胞系中PDK4的表達(dá)增加,且高脂培養(yǎng)基環(huán)境誘導(dǎo)下FXR敲除細(xì)胞會加重脂滴聚集,而干擾PDK4后,脂滴聚集減少�！窘Y(jié)論】FXR缺失會引起肝細(xì)胞脂代謝紊亂,肝臟脂滴聚集,血清中血脂升高,具體機(jī)制與肝細(xì)胞中PDK4表達(dá)上調(diào)有關(guān),抑制PDK4的表達(dá)后能夠改善肝細(xì)胞脂滴聚集,緩解FXR缺失導(dǎo)致的肝脂質(zhì)代謝紊亂。
【圖文】：

24圖 4-1 普通和高脂飲食下 FXR-/-小鼠肝臟解剖表觀、飲食、體重變化和葡萄糖代謝情況隨機(jī)將 FXR-/-和 C57BL/6J 野生型小鼠分成普通飲食（STD）和高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)組，記錄體重和飲食情況，71 天后測定葡萄糖耐量，80 天后測定胰島素敏感實(shí)驗(yàn)，90 天后處死。（A）小鼠解剖肝臟表觀圖。（B）肝臟體重比。（C 和 D）分別為體重和體重增長率。

圖 4-2 FXR-/-小鼠血清中血脂和肝酶指標(biāo)在普通和高脂飲食下的變化情況隨機(jī)將 FXR-/-和 C57BL/6J 野生型小鼠分組成普通飲食（STD）和高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)組，喂養(yǎng) 90 天后處死，測血清各生化指標(biāo)。（A）游離脂肪酸（NEFA）。（B）總膽固醇（TC）。（C）甘油三酯（TG）。（D）高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。（E）低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。（F）谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）。（G）谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）。（H）堿性磷酸酶（ALP）。（I）AST/ALT 比值。n=5，*P<0.05，**P<0.01，***<0.001。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575.5

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1 張茂玉;黃承鈺;王旭;洪君蓉;彭恕生;;魔芋食品對人體脂質(zhì)代謝影響的研究[J];四川生理科學(xué)動態(tài);1987年01期

2 若i餮，

本文編號：2704715