【摘要】：隨著消化內(nèi)鏡技術(shù)的廣泛應(yīng)用,我國(guó)炎癥性腸病(Inflammantory bowel disease,IBD)的檢測(cè)率逐年增加,并且IBD患者如不進(jìn)行及早干預(yù)其患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加,但是目前對(duì)炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制尚缺乏足夠的了解。Erbin(也稱Erbb2ip),最早于1997年作為Erbb2的相互作用蛋白被發(fā)現(xiàn)。它屬于LAP(leucine rich repeat and PDZ domain)蛋白家族的一員。已有的研究表明,Erbin在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、心臟發(fā)育、髓鞘形成以及在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的發(fā)揮著重要作用。Erbin在IBD的作用如何尚不明確。本文主要探討Erbin在炎癥性腸病中發(fā)揮的作用及其相關(guān)機(jī)制。前期我們發(fā)現(xiàn),Erbin基因在人炎癥性腸病臨床標(biāo)本、急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸組織及自發(fā)性慢性炎癥性腸病小鼠(IL-10-/-)腸組織中表達(dá)均較對(duì)照正常結(jié)直腸組織明顯降低。同時(shí)我們觀察到,Erbin△c/△c(Erbin PDZ功能域缺失)的小鼠易感炎癥性腸病。本研究中,我們應(yīng)用crispr/cas9技術(shù)構(gòu)建Erbin完全缺失的小鼠模型(Erbin~(-/-)),該小鼠Erbin第16位外顯子一個(gè)堿基的缺失,造成移碼突變,蛋白提前終止。利用Erbin~(-/-)小鼠模型,我們進(jìn)一步明確了Erbin在IBD中的作用并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了探討。首先,我們使用DSS誘導(dǎo)類似臨床潰瘍性結(jié)腸炎特征的小鼠腸炎模型。通過(guò)監(jiān)測(cè)Erbin~(-/-)及Erbin+/+小鼠的體重,比較其腸重與體重比值,及評(píng)估腸上皮炎癥范圍,隱窩損傷等,進(jìn)一步確定Erbin~(-/-)小鼠較Erbin+/+小鼠更易感腸炎隨后,我們分別在體內(nèi)和體外研究Erbin如何抑制炎癥性腸病的發(fā)生�；贑57小鼠構(gòu)建的潰瘍性結(jié)腸炎模型和IL-10-/-小鼠模型,我們發(fā)現(xiàn),兩種模型小鼠其結(jié)直腸Erbin表達(dá)下調(diào)、自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B表達(dá)增強(qiáng)。進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組小鼠腸上皮相比較,Erbin~(-/-)小鼠腸上皮其LC3B的表達(dá)增強(qiáng)、自噬相關(guān)蛋白ATG16L1和ATG2A表達(dá)減弱。通過(guò)透射電鏡我們檢測(cè)到,自噬溶酶體數(shù)目在Erbin~(-/-)小鼠的結(jié)直腸上皮中較對(duì)照組小鼠結(jié)腸上皮明顯增多;與野生型小鼠相比,DSS誘導(dǎo)后Erbin~(-/-)小鼠結(jié)直腸上皮中自噬溶酶體數(shù)目明顯增多,并伴有廣泛的線粒體腫脹。體外實(shí)驗(yàn)中,我們應(yīng)用TNF-α刺激293T細(xì)胞模擬體內(nèi)炎癥因子對(duì)細(xì)胞的損傷。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn),TNF-α刺激后細(xì)胞自噬小體增多。若用TNF-α刺激低表達(dá)Erbin的細(xì)胞,其自噬小體數(shù)目較單純給予TNF-α刺激明顯增多。RT-PCR檢測(cè)證實(shí),自噬小體數(shù)目增多伴有LC3B在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)增加。同時(shí),我們用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)到TNF-α刺激CT26細(xì)胞22小時(shí),細(xì)胞死亡率為40%;在敲低Erbin的情況下使用TNF-α刺激該細(xì)胞22小時(shí),細(xì)胞死亡率達(dá)到了90%,提示敲低Erbin會(huì)促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。最后,我們用體內(nèi)模型進(jìn)一步驗(yàn)證Erbin是否通過(guò)抑制自噬通路抑制炎癥性腸病。我們?cè)贒SS誘導(dǎo)Erbin~(-/-)小鼠炎癥性腸病模型的同時(shí),用自噬的抑制劑氯喹作用于該小鼠,HE染色發(fā)現(xiàn)與未使用氯喹的Erbin~(-/-)小鼠相比,自噬抑制劑氯喹的使用能顯著減緩改善DSS誘導(dǎo)的Erbin~(-/-)小鼠結(jié)直腸粘膜的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和隱窩上皮細(xì)胞損傷。與此同時(shí),我們檢測(cè)到使用氯喹后DSS誘導(dǎo)的Erbin~(-/-)小鼠結(jié)直腸上皮中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量較未使用氯喹的DSS誘導(dǎo)Erbin~(-/-)小鼠下降。綜上所述,我們的研究明確了Erbin在炎癥性腸病中的重要作用,并初步發(fā)現(xiàn)Erbin基因可通過(guò)抑制細(xì)胞自噬性死亡抑制炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展,這為臨床炎癥性腸病的治療提供了新的線索。
【圖文】：

rbin 通過(guò)抑制自噬性細(xì)胞死亡延緩炎癥性腸病進(jìn)程的研究 第二第二章 材料與方法1.材料1.1 小鼠Erbin-/-小鼠：SPF級(jí)別實(shí)驗(yàn)中心繁育，Erbin完全缺失小鼠�；贑57背景鼠用CRISPR/cas9技術(shù)構(gòu)建，A圖中所示Erbin第16位外顯子中A堿基的缺失，，造碼突變，蛋白提前終止。B中WB檢測(cè)繁育的Erbin-/-小鼠結(jié)直腸幾乎不表達(dá)該。同時(shí)RT-PCR檢測(cè)繁育的Erbin-/-小鼠結(jié)直腸幾乎不表達(dá)該蛋白，*P < 0t-test)。

19圖 1-1 Erbin 缺失后小鼠腸道炎癥反應(yīng)和上皮損傷情況 （A）3.5 月齡和 9 月齡Erbin-/-小鼠和 Erbin+/+小鼠大體和鏡下 HE 結(jié)直腸變化（B）在 3.5 個(gè)月大和 9 個(gè)月大的 Erbin-/-和 Erbin+/+小鼠中，炎癥的組織病理學(xué)評(píng)分，炎癥范圍深度和隱窩損傷。 數(shù)據(jù)表示為每組小鼠的百分比與指示的分?jǐn)?shù)Figure1-2 Figure 3: Intestinal inflammatory response and epithelial injury inexperimental IBD mouse model after Erbin was deleted. (A) Gross appearance andrepresentative H&E staining of colorectum in 3.5-month-old and 9- month-oldErbin-/-mice and Erbin+/+mice. (B) Histopathological scorings of the inflammation,depth of inflammation, and crypt damage of colorectum in 3.5-month- old and9-month-old Erbin-/-mice and Erbin+/+mice. Data are represented as the percentage ofmice per group with the indicated score.
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R574

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Lauren Van Der Kraak;Philippe Gros;Nicole Beauchemin;;Colitis-associated colon cancer:Is it in your genes?[J];World Journal of Gastroenterology;2015年41期

本文編號(hào)：2704666