發(fā)布時間：2020-06-09 10:20

【摘要】： 乙型肝炎是危害人民健康的重要疾病。雖然在其發(fā)病機(jī)制取得了多方面的進(jìn)展,但仍有許多重要問題需要闡明。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)本身通常并不直接導(dǎo)致肝細(xì)胞損害,而大量淋巴細(xì)胞浸潤肝臟提示細(xì)胞免疫與乙型肝炎肝細(xì)胞的損傷密切相關(guān)。HBV抗原表位特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)應(yīng)答是機(jī)體清除或控制肝細(xì)胞內(nèi)HBV感染的主要機(jī)制。病毒蛋白中的CTL表位(epitope)是特異性CTL識別和攻擊的目標(biāo)。由于CTL表位的遞呈受到宿主HLA-I類分子的限制,同時HBV基因型對CTL的變異影響明顯,因而研究患者的CTL表位變異時需要確定患者的HLA-I分型和感染的HBV基因型。本研究應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測序法,通過對HBV基因組全序列的測定,分析了急性乙型肝炎(acute hepatitis B, AHB)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)和慢性重型乙型肝炎(chronic severe hepatitis B, CSHB)患者的HBV特異性HLA-A2限制性CTL表位變異情況,同時根據(jù)序列確定HBV基因型并分析了其對CTL表位變異的影響,旨在找到可能與乙型肝炎病程發(fā)生發(fā)展相關(guān)的表位變異。結(jié)果總結(jié)如下: 1.運用“重疊兩段法”巢式PCR擴(kuò)增HBV基因組全序列。獲得516例乙型肝炎患者HBV全序列,其中AHB患者131例(已提交GenBank);CHB患者239例(GenBank號: FJ386574-FJ386689 , FJ562218-FJ562340 ); CSHB146例( GenBank號:EU939536-EU939681)。 2.運用MEGA 4.0軟件分析HBV全序列構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行HBV基因分型。其中急性乙型肝炎患者中,B基因型27例占20.6%;C基因型103例占78.6%;D基因型1例占0.8%;慢性乙型肝炎患者中,B基因型51例占21.3%;C基因型184例占77.0%;D型4例占1.7%;慢性重型乙型肝炎中,B基因型33例占22.6%;C基因型111例占76.0%;D基因型2例占1.4%。三組患者的病毒基因型構(gòu)成比無顯著差異。 3.通過血清學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法對516例乙型肝炎患者進(jìn)行HLA-A2基因分型。結(jié)果AHB患者中HLA-A2陽性67例,占51.1%;CHB患者中HLA-A2陽性109例,占45.6%;CSHB炎患者中HLA-A2陽性71例,占48.6%。三者之間統(tǒng)計學(xué)上沒有差異,與文獻(xiàn)報道的健康人群陽性比例也沒有明顯差異。 4.根據(jù)文獻(xiàn)報道已經(jīng)鑒定過的HBV特異性HLA-A2限制性CTL表位來分析獲得的HLA-A2陽性患者的表位變異結(jié)果。所有HBV基因型患者一起進(jìn)行比較時,X92-100和S177-185表位變異發(fā)生率在AHB、CHB和CSHB三組患者有極顯著差異(P均0.01)。.僅HBV B基因型患者進(jìn)行比較時,P455-463和P816-824表位變異發(fā)生率在三組患者間有極顯著差異(P均0.01)。僅HBV C基因型患者進(jìn)行比較時,三組患者間有6個表位變異發(fā)生率有顯著或非常顯著差異,包括X92-100(P0.01)、X102-110 (P0.05)、X115-123 (P0.05)、S131-139 (P0.05)、S177-185 (P0.01)和S183-191 (P0.05)。此外,S335-343 (P=0.05)和S269-278 (P=0.11)表位變異發(fā)生率也有明顯差別,雖然P值未達(dá)到顯著差異,但經(jīng)SAS軟件趨勢檢驗,三組患者在該表位有相關(guān)趨勢,增大樣本量可達(dá)到顯著差異。多數(shù)變異表位中只有一個氨基酸發(fā)生了替換,少數(shù)表位可有多個氨基酸發(fā)生改變,例如X36-44、S201-210和S204-212表位。由于一些表位相互重疊,包括S177-185和S183-191、S201-210和S204-212、S269-278和S271-280、S335-343和S338-347表位間,從而一個位點的氨基酸變化可以引起兩個CTL表位同時變異。表位C18-27(FLPSDFFPSV)247例患者中有227例(占91.9%)突變?yōu)镕LPSDFFPSI,而表位X52-60(HLSLRGLFV)和表位S370-379(SIVSPFIPLL)突變率都為100%,分別突變?yōu)镠LSLRGLPV和NIVSPFIPLL。 根據(jù)以上結(jié)果分析,某些HBV特異性HLA-A2限制性CTL表位變異發(fā)生率與疾病嚴(yán)重程度相關(guān),提示CTL表位變異可能是影響乙型肝炎慢性化和重癥化進(jìn)程的一個病毒學(xué)因素。
【圖文】：

liver failure, ACLF)，死亡率較高。上述復(fù)雜疾病譜的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，一致認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制中免疫反應(yīng)密切相關(guān)，受 HLA-I 類分子嚴(yán)格限制的特異性 別感染肝細(xì)胞是造成肝損傷的主要原因。因此，研究病毒感染誘發(fā)的特異性免疫明感染的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。1.1 乙型肝炎病毒（HBV）概述1.1.1 HBV 基因組特點HBV 是一種有包膜的雙鏈 DNA 病毒，屬于嗜肝病毒科。HBV 的基因組是部鏈的 DNA 分子，長度約為 3200bp(如圖 1)。兩條線性 DNA 鏈通過 5’端間的 22性末端構(gòu)成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，粘性末端的兩側(cè)各有一個 11bp 組成的直接重復(fù)序列，被DR1 和 DR2。在 HBV 顆粒內(nèi)，HBV 負(fù)鏈的長度是固定，有明確的 5’和 3’端，但負(fù)鏈并不是閉環(huán)結(jié)構(gòu)，在正鏈的 5’ 末端附近，負(fù)鏈上有一缺口，并且，負(fù)鏈的有 8～9bp 的冗余，使這一小段成為 3 鏈結(jié)構(gòu)。HBV 多聚酶(polymerase, pol)與負(fù)5`端通過共價鍵結(jié)合。正鏈的 5`端附著一個 18bp 長的寡核糖核苷酸，具有RNA(mRNA)一樣的帽狀結(jié)構(gòu)。正鏈的 3`末端長度不固定，因此大多數(shù) HBV 基因含有一段單鏈的、長度不一的缺口區(qū)域(gap region)，這段區(qū)域可借助內(nèi)源性的DNA 多聚酶補(bǔ)齊而成為雙鏈[5]。

在 B、C 型高度流行的亞洲國家,家族垂直傳播和懷孕圍產(chǎn)期感染為 HBV要感染傳播方式。相反,A、D、E、F 和 G 基因型則主要存在于以水平傳播為主的感染式的地域。HBV 基因型與感染傳播方式是否相關(guān)仍需進(jìn)一步研究證實。.1.4 HBV 感染與宿主免疫間的關(guān)系在 HBV 的感染過程中，CTL 細(xì)胞對于病毒的清除起著重要作用。CTL 細(xì)胞識別在大數(shù)宿主肝細(xì)胞表面表達(dá)的 MHC－I 類分子和多肽片段形成的復(fù)合物。因此，，它能夠直識別被病毒感染的細(xì)胞，并在感染部位發(fā)揮主要效應(yīng)（如圖 2）。被感染細(xì)胞內(nèi)的病蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)酶的作用被降解，這些降解產(chǎn)物借助于 TAP 轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[15]。在質(zhì)網(wǎng)中轉(zhuǎn)運的多肽與 MHC－I 類分子的重鏈結(jié)合，形成穩(wěn)定的 I 類分子-β2 微球蛋復(fù)合體，經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運至細(xì)胞表面。CTL 細(xì)胞識別細(xì)胞表面的這些 I 類分子－肽合物后，通過兩種途徑發(fā)揮抗病毒作用。一是釋放細(xì)胞殺傷因子（IFN-γ 和 TNF-），另一是直接釋放溶細(xì)胞顆粒（內(nèi)含穿孔素和絲氨酸酯酶）穿孔素可在靶細(xì)胞膜上孔，絲氨酸酯酶由此進(jìn)入靶細(xì)胞核內(nèi)，導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡[16-17]。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2704548