【摘要】： 目的：構(gòu)建含全長(zhǎng)HMGB1及HMGB1 A盒蛋白基因的原核表達(dá)質(zhì)粒,并分離純化出相應(yīng)的蛋白。 方法：從正常小鼠肝臟中提取總RNA為模板,設(shè)計(jì)2對(duì)引物,經(jīng)PCR轉(zhuǎn)錄出全長(zhǎng)HMGB1及HMGB1-A盒基因片段；利用克隆載體PMD-18T構(gòu)建克隆載體PMD-18T-HMGB1和PMD-18T-HMGB1-Abox,由公司測(cè)序確定為正確序列,經(jīng)BamH、Xol I (Hand III)雙酶切后,與同樣雙酶切的原核載體PET-28a連接,最終得到帶6-His標(biāo)簽的小鼠PET28a-HMGB1與PET28a-HMGB1-Abox原核質(zhì)粒；測(cè)序證實(shí)后,將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21,以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(ITPG)誘導(dǎo)后經(jīng)鎳離子親和層析柱親和純化得到目的蛋白HMGB1及HMGB1-Abox。 結(jié)果：構(gòu)建的全長(zhǎng)HMGB1與HMGB1-A盒基因的原核質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切、PCR、測(cè)序證明各基因均正確的插入到原核質(zhì)粒中且讀碼框未發(fā)生移位；誘導(dǎo)純化分離出的蛋白經(jīng)SDS-PAGE及BAC法檢測(cè)證實(shí)為目的蛋白,即全長(zhǎng)HMGB1蛋白與HMGB1-A盒蛋白。 結(jié)論：成功構(gòu)建小鼠原核質(zhì)粒PET28a-HMGB1與PET28a-HMGB1-Abox,并得到純度較高的重組HMGB1蛋白與HMGB1-A盒蛋白。 目的：觀察重組HMGB1蛋白在體內(nèi)外對(duì)炎癥反應(yīng)的作用。 方法：體外實(shí)驗(yàn)：以不同濃度的重組HMGB1蛋白單獨(dú)或聯(lián)合LPS作用于小鼠單核細(xì)胞系RAW264.7,CCK8試劑盒檢測(cè)其對(duì)小鼠單核細(xì)胞活力的影響。以LPS和重組HMGB1蛋白聯(lián)合為實(shí)驗(yàn)組1,重組HMGB1蛋白及LPS單獨(dú)作為實(shí)驗(yàn)組1’及對(duì)照組,空白組給予PBS。于2、6、12、24、48h檢測(cè)其細(xì)胞上清中的TNF-a,IL-1β的含量,WESTBLOT、免疫熒光法觀察細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)、RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中HMGB1-mRNA變化趨勢(shì)。體內(nèi)試驗(yàn)：試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組,對(duì)照組用脂多糖和D-氨基半乳糖胺制備小鼠急性肝衰竭模型,實(shí)驗(yàn)組1在此基礎(chǔ)上給予腹腔注射重組HMGB1蛋白,實(shí)驗(yàn)組1’僅腹腔注射重組HMGB1蛋白,空白組僅腹腔注射等滲鹽水,于2、4、6、8、12、24h免疫組織化學(xué)檢測(cè)其肝組織中HMGB1表達(dá)的變化情況、逆轉(zhuǎn)錄-PCR檢測(cè)其HMGB1-mRNA變化趨勢(shì)、ELISA檢測(cè)血清中TNF-a,IL-1β的含量。以上數(shù)據(jù)通過配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。 結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)：小鼠單核細(xì)胞活力與重組HMGB1蛋白濃度及作用時(shí)間呈負(fù)相關(guān)；與空白組相比,實(shí)驗(yàn)組1、1’與對(duì)照組細(xì)胞上清TNF-a、IL-1β的含量顯著增高,二者均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；WESTBLOT及免疫熒光檢測(cè)提示實(shí)驗(yàn)組1細(xì)胞中HMGB1表達(dá)不斷增加；細(xì)胞中HMGB1-mRNA含量及峰值均較空白組與對(duì)照組顯著增前。體內(nèi)試驗(yàn)：添加重組HMGB1蛋白的實(shí)驗(yàn)組肝組織中肝臟壞死情況明顯惡化并加速,HMGB1和HMGB1-mRNA的表達(dá)較對(duì)照組增高且表達(dá)時(shí)間提前；實(shí)驗(yàn)組1TNF-a于2h開始上升,12h達(dá)到峰值(545.84±25.01)pg/ml,明顯高于實(shí)驗(yàn)組1’(398.73±35.29pg/ml)和對(duì)照組(473.42±22.99pg/ml),兩組比較P0.05；實(shí)驗(yàn)組1 IL-1β血清IL-1β在2h就達(dá)到峰值(1016.27±26.98pg/ml),同樣高于其余三組P0.05。而實(shí)驗(yàn)組1’和對(duì)照組之間則不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,二組之間水平相近,僅在峰值時(shí)間上略有不同。 結(jié)論：重組HMGB1蛋白在體外可以增加小鼠單核細(xì)胞在受到LPS刺激時(shí)HMGB1的表達(dá)和分泌；在體內(nèi)可以顯著增加急性肝衰竭時(shí)肝組織HMGB1的表達(dá)和分泌,極大地促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生、加速炎癥反應(yīng)的發(fā)展。 目的：觀察重組HMGB1-Abox蛋白在體內(nèi)外對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用。 方法：體外實(shí)驗(yàn)：以不同濃度的重組HMGB1-Abox蛋白作用于LPS刺激的小鼠單核細(xì)胞系RAW264.7,CCK8試劑盒檢測(cè)其對(duì)小鼠單核細(xì)胞活力的影響。以PBS和重組HMGB1-Abox蛋白為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,于2、6、12、24、48h檢測(cè)其細(xì)胞上清中的TNF-a,IL-1p的含量,WESTBLOT、免疫熒光法觀察細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)、RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中HMGB1-mRNA變化趨勢(shì)。體內(nèi)試驗(yàn)：用脂多糖和D-氨基半乳糖胺制備小鼠急性肝衰竭模型,對(duì)照組腹腔注射等滲鹽水,實(shí)驗(yàn)組腹腔注射重組HMGB1-Abox蛋白,于2、4、6、8、12、24h免疫組織化學(xué)檢測(cè)其肝組織中HMGB1表達(dá)的變化情況、逆轉(zhuǎn)錄-PCR檢測(cè)其HMGB1-mRNA變化趨勢(shì)、ELISA檢測(cè)血清中TNF-a,IL-1β的含量。以上數(shù)據(jù)通過配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。 結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)：小鼠單核細(xì)胞活力與重組HMGB1-Abox蛋白濃度及作用時(shí)間呈正相關(guān)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清TNF-a、IL-1β的含量較對(duì)照組顯著下降：對(duì)照組TNF-α一直保持上升趨勢(shì)直至48h達(dá)到峰值(6156.86±75.21pg/mL)；IL-1β在12h時(shí)即達(dá)到峰值(3426.03±30.54pg/mL),隨后緩慢下降。實(shí)驗(yàn)組TNF-α48h到達(dá)峰值(4237.72±63.89pg/mL)；IL-1β在24h升至頂峰(3164.99±53.56pg/mL),均較對(duì)照組顯著下降,二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；WESTBLOT及免疫熒光檢測(cè)提示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中HMGB1表達(dá)不斷減少；細(xì)胞中HMGB1-mRNA含量及峰值均較對(duì)照組顯著減少且延后。體內(nèi)試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組肝組織中肝臟壞死情況明顯好轉(zhuǎn),HMGB1和HMGB1-mRNA的表達(dá)較對(duì)照組降低且表達(dá)時(shí)間延后；實(shí)驗(yàn)組TNF-a于4h開始上升,12h達(dá)到峰值(334.12±39.13)pg/ml,對(duì)照組于8h達(dá)到峰值(473.42±22.99)pg/ml,兩組比較,t=-11.387,P0.05；實(shí)驗(yàn)組IL-1β自2h起隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,在6h達(dá)到峰值(341.31±25.01)pg/ml,對(duì)照組于2h達(dá)到峰值(724.49±34.24)pg/ml,兩組比較,t=-7.999,P0.05。 結(jié)論：重組HMGB1-Abox蛋白在體外可以降低小鼠單核細(xì)胞在受到LPS刺激時(shí)HMGB1的表達(dá)和分泌；在體內(nèi)可以顯著減少急性肝衰竭時(shí)肝組織HMGB1的表達(dá)和分泌,有效的阻斷HMGB1對(duì)其他早期炎性因子的促進(jìn)作用。
【圖文】：

4.1ITPG誘導(dǎo)后的重組HMGBI蛋白在ZIKD大小處有明顯增加，經(jīng)SDS爪AGE電泳，在 20mm0FL咪哇緩沖液洗脫時(shí)，出現(xiàn)明顯雜帶，在200mmo比咪哇緩沖液洗脫時(shí)，目的蛋白含量最高，可以得到單一，清晰地條帶。見圖5。側(cè)..卜A:ITPG誘導(dǎo)前B:ITpG誘導(dǎo)后C:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品D:200mmo比咪哇緩沖液洗脫液..，.導(dǎo)D圖5重組HMGBI蛋白SDS一PAGE電泳圖 4.2ITPG誘導(dǎo)后的重組HMGBI一Abox蛋白在14KD大小處有明顯增加，經(jīng)SDS/RAGE電泳，在 30mmol幾咪哇緩沖液洗脫時(shí)，出現(xiàn)明顯雜帶，在50~OUL咪哇緩沖液洗脫時(shí)，目的蛋白含量最高，可以得到單一，，清晰地條帶。見圖6。A:ITPG誘導(dǎo)前B:ITPG誘導(dǎo)后C:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品D:SOmmo譏咪哇緩沖液洗脫液圖6重組HMGBI一Abox蛋白SDS一以GE電泳圖

4.2ITPG誘導(dǎo)后的重組HMGBI一Abox蛋白在14KD大小處有明顯增加，經(jīng)SDS/RAGE電泳，在 30mmol幾咪哇緩沖液洗脫時(shí)，出現(xiàn)明顯雜帶，在50~OUL咪哇緩沖液洗脫時(shí)，目的蛋白含量最高，可以得到單一，清晰地條帶。見圖6。A:ITPG誘導(dǎo)前B:ITPG誘導(dǎo)后C:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品D:SOmmo譏咪哇緩沖液洗脫液圖6重組HMGBI一Abox蛋白SDS一以GE電泳圖
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R575.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉輝,姚詠明,董月青,盛志勇;內(nèi)毒素刺激大鼠腹腔巨噬細(xì)胞高遷移率族蛋白B1釋放的研究[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2005年01期

本文編號(hào)：2704223