【摘要】： 各種因素所致的慢性肝臟損傷,都可能發(fā)生肝細(xì)胞炎癥、壞死,進(jìn)而發(fā)展成為肝纖維化或肝硬化,治療上目前尚無理想的治療方法。肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor HGF)作為一種多功能生長因子,是由肝臟的儲脂細(xì)胞生成的一種具有強烈有絲分裂原活性的蛋白質(zhì),它不僅能夠刺激原代鼠肝細(xì)胞DNA的合成,參與多種細(xì)胞的增殖、遷移和形態(tài)發(fā)生,對多種成熟的器官/組織有營養(yǎng)修復(fù)作用,促進(jìn)肝、腎、肺等損傷器官的再生,而且對各種因素引起的肝纖維化具有良好的拮抗和治療作用。因此,應(yīng)用HGF治療各種慢性肝損傷、肝纖維化也是明智的選擇。 雖已應(yīng)用于臨床,其來源主要是從人血漿、胎盤、或動物的胎肝中提取純化,是單鏈pro-HGF與異二聚體HGF的混合物,費時、費力、活性差、成本昂貴、體內(nèi)半衰期短,需要反復(fù)應(yīng)用才維持體內(nèi)血藥濃度,采用基因治療的方法或利用基因工程表達(dá)重組人HGF是大量獲取具有生物學(xué)活性HGF的有效途徑。為此,我們構(gòu)建了攜帶人HGF全長基因片斷的真核表達(dá)質(zhì)粒,建立了轉(zhuǎn)染PCI-new-HGF/HL-7702細(xì)胞、轉(zhuǎn)染PCI-new-HGF/CFSC-2G細(xì)胞模型和大鼠肝纖維化模型,測定其轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞后的生物學(xué)效應(yīng)。并在建立大鼠肝纖維化模型上觀察其在體內(nèi)的作用,為進(jìn)一步證實HGF的生物學(xué)效應(yīng)提供了理論依據(jù)和實驗依據(jù)。 有研究報道HGF可抑制轉(zhuǎn)移生長因子β(Transforming growth factor TGF-β)基因的轉(zhuǎn)錄水平,促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)的表達(dá),從而抑制星狀細(xì)胞的激活,降低肌成纖維細(xì)胞α-肌動蛋白(α-smooth muscle actinα-SMA)的表達(dá),但目前尚沒有HGF對肝細(xì)胞凋亡、肝星狀細(xì)胞凋亡的研究,為探討HGF對肝細(xì)胞、HSC的作用及機(jī)制,我們還用PCI-neo-HGF轉(zhuǎn)染了人正常肝細(xì)胞株(HL-7702)、大鼠星狀細(xì)胞株(CFSC-2G)。采用CCl4誘導(dǎo)HL-7702細(xì)胞的凋亡,刺激CFSC-2G細(xì)胞株, 觀察HL-7702細(xì)胞、CFSC-2G細(xì)胞的caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示CCl4損傷后轉(zhuǎn)染PCI-new-HGF的HL-7702細(xì)胞后,caspase-3蛋白表達(dá)量較CCl4損傷/HL-7702細(xì)胞、PCI-neo/HL-7702細(xì)胞明顯降低,caspase-8、caspase-9沒有變化;轉(zhuǎn)染PCI-neo-HGF/CFSC-2G細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)量較CCl4誘導(dǎo)的CGFS-2G增加,且檢測到caspase-9,提示PCI-neo-HGF轉(zhuǎn)染HL-7702細(xì)胞后,能夠?qū)笴Cl4損傷人肝細(xì)胞(HL-7702)的凋亡。而拮抗CCl4誘導(dǎo)的HL-7702細(xì)胞的凋亡的作用很可能是通過下調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)途徑實現(xiàn)的;PCI-neo-HGF促進(jìn)大鼠CFSC-2G細(xì)胞的凋亡,其可能的作用機(jī)制與上調(diào)caspase-3、-9蛋白表達(dá)有關(guān)。 應(yīng)用HGF基因?qū)δＰ褪筮M(jìn)行抗纖維化的體內(nèi)研究,結(jié)果顯示經(jīng)過PCI-neo-HGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的實驗鼠治療組,預(yù)防給藥組、治療1組,纖維組織增生較模型對照組減輕,假小葉形成率低,且程度輕,未見典型的假小葉,肝細(xì)胞脂肪變性也較模型對照組減輕,炎性細(xì)胞浸潤較空載質(zhì)粒組明顯減輕,預(yù)防給藥組、治療1組的部分大鼠肝病理變化不明顯,接近正常肝組織,接近丹參治療組。相比較治療1組而言,預(yù)防給藥組纖維組織增生較少,局限于匯管區(qū),以肝細(xì)胞脂肪變性為主,假小葉形成率較低,且全部成活。提示經(jīng)過PCI-neo-HGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對有一定的保護(hù)肝細(xì)胞、抗肝纖維化的治療作用,值得進(jìn)一步研究。 為進(jìn)一步的臨床使用提供了重要的理論基礎(chǔ)、技術(shù)路線和實驗方法。
【圖文】：

圖1 HGF啟動子及其調(diào)控元件Fig. 1 The promoter and regulatory elements of HGF可見HGF的表達(dá)有非常復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，，徹底清楚HGF的表達(dá)調(diào)控仍一步的研究，序列分析推定的某些調(diào)控元件還有待實驗證實，激素和細(xì)子調(diào)控的信號傳遞途徑也有待深入認(rèn)識。

可用于COS7的轉(zhuǎn)染。電泳結(jié)果見圖4圖5：PCI- new-HGFCDNASamI/SalI雙酶切鑒定電泳圖譜Fig5. PCI-neo-HGF digested by SamI and SalILane 1: λDNA/ Hind Ⅲ marker；lane 2: SamI；lane 3: SalI；lane 4: SamI and SalI 5472bp 2200bp
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R575.2

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王紅月;肝細(xì)胞生長因子對慢性腎衰竭腎臟保護(hù)作用的研究[D];吉林大學(xué);2012年

本文編號：2704017