【摘要】： 目的:通過測定慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B, CHB)患者外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMCs)中病毒核酸識別受體-TLR9(Toll like receptor 9, TLR9)的表達情況,了解HBV感染與TLR9的相關(guān)關(guān)系。并通過CpG寡脫氧核苷酸( CpG oligodeoxynucleotides, CpG-ODN)對CHB患者PBMCs中TLR9調(diào)節(jié)作用的研究,探討是否可以通過CpG-ODN對CHB患者PBMCs中TLR9表達的調(diào)節(jié),起到抵抗HBV感染的作用,為今后抗HBV感染有效藥物的篩選提供實驗平臺。 方法:(1)收集入院治療的CHB患者,檢測乙肝兩對半和HBV DNA拷貝數(shù),據(jù)測定結(jié)果設(shè)實驗組(CHB患者組),對照組(健康志愿者組)。采用Optiprep(TM混合法)分離實驗對象PBMCs,RT-PCR法檢測PBMCs中TLR9 mRNA的表達情況。(2)CpG-ODN分別對CHB患者和健康志愿者PBMCs進行體外刺激,以1640培養(yǎng)基為非刺激空白對照。通過RT-PCR方法檢測刺激前后TLR9 mRNA的表達情況;ELISA方法檢測PBMCs培養(yǎng)上清中IFN-α的濃度;細胞組織化學(xué)方法檢測刺激前后TLR9蛋白水平的表達情況。 結(jié)果:(1)CHB患者PBMCs中TLR9的表達情況:RT-PCR結(jié)果顯示CHB患者組TLR9在PBMCs中的表達明顯低于健康對照組(P0.01)(;2)CpG-ODN體外刺激PBMCs后TLR9的表達情況:RT-PCR結(jié)果證明,CpG-ODN刺激后CHB患者和健康志愿者PBMCs TLR9 mRNA的表達均明顯高于其各自的1640空白對照組(P0.01,P0.01);但是,CpG-ODN體外刺激后,CHB患者CpG-ODN刺激組TLR9 mRNA的表達仍低于健康志愿者1640空白對照組(P0.01);(3)CpG-ODN體外刺激PBMCs后IFN-α的分泌情況:CpG-ODN體外刺激后,CHB患者和健康志愿者PBMCs分泌IFN-α的水平分別與其各自的1640空白對照組相比較有明顯增加(P0.01,P0.01);但是CpG-ODN刺激后,CHB患者PBMCs分泌IFN-α的水平低于健康志愿者(P0.01);(4)PBMCs中TLR9 mRNA的表達與培養(yǎng)上清中IFN-α含量的相關(guān)性分析:PBMCs中TLR9 mRNA的表達與培養(yǎng)上清中IFN-α的含量呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.686(P0.01);(5)細胞免疫化學(xué)結(jié)果證明,CpG-ODN刺激后CHB患者和健康志愿者PBMCs胞漿中TLR9的受體表達陽性率均有所升高。 結(jié)論:CHB患者PBMCs中TLR9表達顯著低于健康對照,提示CHB患者PBMCs識別HBV核酸DNA的能力下降;CHB患者和健康對照PBMCs中TLR9的表達與IFN-α的分泌存在明顯正相關(guān)性,提示TLR9的表達水平與CHB患者和健康對照PBMCs抗HBV感染的能力存在相關(guān)關(guān)系;CpG-ODN可以有效地激活CHB患者和健康對照PBMCs中TLR9的表達,同時增強PBMCs對I-型IFN的分泌,提示可以通過采用CpG-ODN促使機體的天然免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗HBV感染的效應(yīng)。
【圖文】：

標本 PBMCs 提取總 RNA，取等量（10μl）加入各瓊脂糖加樣孔中進行1 可見由 PBMCs 提取的細胞總 RNA 質(zhì)量較好，經(jīng) 1.2V 15min，清晰可見 18s 和 28s 兩條電泳條帶，28s 條 18s 條帶。提取產(chǎn)物無 DNA 污染，無降解。 結(jié)果物電泳，進行光密度掃描分析，目的條帶 TLR9 與光密度比值即為半定量分析結(jié)果。

各實驗組，取等量（5μl）內(nèi)參β-actin與TLR9PCR產(chǎn)物，加入同一瓊脂糖加樣孔中電泳
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R512.62

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 高珍;HBcAg重組腺病毒轉(zhuǎn)染人PBMCs對TLR9和IRF7表達的影響[D];南昌大學(xué);2011年

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本文編號：2703392