【摘要】： 目的為研究人PBMC TLR3在人HBV感染和HBV宮內(nèi)感染中的作用,本課題采用人群研究和體外實驗相結(jié)合的方法,從基因和蛋白水平初步了解正常孕婦人群與HBsAg陽性孕婦人群PBMC TLR3的表達情況以及與HBV感染和HBV宮內(nèi)感染的關(guān)系,根據(jù)人群研究的線索進一步進行體外實驗,探索TLR3在抗HBV感染中的作用機制。 1.了解HBsAg陽性孕婦及其新生兒外周血單個核細胞(PBMC)HBV感染的狀況; 2.了解TLR3在PBMC的表達情況; 3.探討TLR3與HBV感染和HBV宮內(nèi)感染的關(guān)系; 4.探討TLR3抗病毒生物學效應的機制。 方法1.人群研究 ①以2004年7月至2006年1月由太原市傳染病院婦產(chǎn)科進行產(chǎn)前檢查并分娩的HBsAg陽性孕婦為研究隊列,從產(chǎn)前檢查追蹤觀察至分娩,共收集HBsAg陽性孕婦及其新生兒228對。采集孕婦分娩前肘靜脈血和新生兒出生24小時內(nèi)注射乙肝疫苗前的股靜脈血,同時收集其流行病學資料,用免疫熒光雙標記的方法檢測HBsAg陽性孕婦及其新生兒PBMC涂片上HBsAg的表達及TLR3的分布;用巢式病例對照研究的方法進行TLR3與PBMC HBV感染,TLR3與PBMC HBV宮內(nèi)感染的研究。以PBMC HBV感染者為病例組,非感染者為對照組,分析HBsAg陽性孕婦及新生兒PBMC TLR3表達與PBMC HBV感染的關(guān)系; ②于2006年11月至2007年4月,從太原市傳染病院婦產(chǎn)科選取外周血HBsAg陽性的足月分娩孕產(chǎn)婦及其新生兒共28對,同期從山西省婦幼保健院婦產(chǎn)科收集正常足月分娩孕產(chǎn)婦26例作為正常孕婦對照,采集孕婦肘靜脈血和新生兒出生后24小時內(nèi)注射乙肝疫苗前的股靜脈血,用熒光定量PCR定量檢測HBsAg陽性孕婦及其新生兒血清HBVDNA,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測乙肝標志物,用RT-PCR方法檢測正常孕婦和HBsAg陽性孕婦PBMC TLR3 mRNA,分析PBMC TLR3 mRNA與HBV感染的關(guān)系;用real-time RT-PCR方法檢測HBsAg陽性孕婦及其新生兒PBMC TLR3 mRNA,分析PBMCTLR3 mRNA與HBV感染及HBV宮內(nèi)感染的關(guān)系;ELISA方法分別檢測HBsAg陽性孕婦和正常孕婦血清中IL-2、6的濃度,分析HBV感染與細胞因子的關(guān)系及TLR3與細胞因子分泌的關(guān)系。 2.體外實驗 ①于2007年4月至2007年10月從山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院婦產(chǎn)科收集正常足月分娩孕產(chǎn)婦26例,收集其肘靜脈及流行病學資料。分離外周血PBMC,用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液進行原代細胞培養(yǎng),設(shè)HBV刺激組和正常對照組,在培養(yǎng)2、4、6天后分別收集PBMC細胞和培養(yǎng)上清,real-time RT-PCR方法檢測PBMC的TLR3 mRNA,FACs方法檢測PBMC的TLR3蛋白,ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液IL-2、6、10、12、IFN-γ和TNF-α的濃度; ②用RNAi技術(shù)沉默正常獻血者PBMC TLR3 mRNA,用TLR3的配體PolyI:C刺激活化TLR3,并在相應處理后與一定量的HBV共孵育6天,在2,4,6天分別收集PBMC細胞和培養(yǎng)上清,real-time RT-PCR檢測TLR3 mRNA,FACs檢測TLR3蛋白,熒光定量PCR定量檢測培養(yǎng)上清和PBMC中HBV DNA含量。 3.統(tǒng)計分析資料查實后輸入數(shù)據(jù)庫,采用SPSS 13.0 for windows軟件進行統(tǒng)計分析,計數(shù)資料采用χ~2分析,計算各指標陽性率、χ~2值、OR值及其95%可信區(qū)間;計量資料采用t檢驗、配對t檢驗、方差分析及相關(guān)性分析。 結(jié)果1.HBsAg陽性孕婦PBMC TLR3蛋白和PBMC HBV感染的關(guān)系 ①HBsAg分布在PBMC胞膜和胞漿部位;TLR3分布在胞膜上,TLR3在不同PBMC涂片中表達強度不同,同一視野下不同的細胞表達強度也不同,且在TLR3表達強的細胞上HBsAg表達弱。 ②228例HBsAg陽性孕婦有64例(28.07%) PBMC HBsAg陽性;161例(70.61%)TLR3強表達;TLR3在PBMC HBV感染組和非感染組的表達差異有統(tǒng)計學意義(χ~2=30.944,P＜0.0001);新生兒有35例(15.35%) PBMC HBsAg陽性;HBsAg陽性孕婦PBMC TLR3的表達與新生兒PBMC HBV宮內(nèi)感染有關(guān)(χ~2=12.354,P＜0.0001)。TLR3可能是HBsAg陽性孕婦PBMC HBV感染的保護因素(OR=0.181,95%CI=0.091-0.340),也是PBMC HBV宮內(nèi)感染的保護因素(OR=0.279,95%CI=0.133-0.585)。 2.人群PBMC TLR3 mRNA與HBV感染的關(guān)系 ①用RT-PCR檢測HBsAg陽性孕婦組和正常孕婦組PBMC TLR3 mRNA,HBsAg陽性孕婦組TLR3 mRNA的相對表達量(0.8164±0.1608)高于正常孕婦組(0.3892±0.1879),其差異有統(tǒng)計學意義(t=-8.997,P＜0.001)。 ②用real-time RT-PCR檢測正常孕婦、HBsAg孕婦及其新生兒PBMC TLR3 mRNA,HBsAg陽性孕婦組TLR3 mRNA的相對表達量高于正常孕婦組(t=9.14,P＜0.0001)。在HBsAg陽性孕婦組中又分為DNA陰性組,≤10~4copies/ml組和＞10~4copies/ml組,TLR3 mRNA在這三組中差別無統(tǒng)計學意義(F=0.468,P＞0.05);且在HBsAg陽性孕婦組中的大三陽組和非大三陽組TLR3 mRNA差別無統(tǒng)計學意義(t=0.355,P=0.725);在HBsAg陽性孕婦組中的HBV宮內(nèi)感染組和非HBV宮內(nèi)感染組,TLR3 mRNA差別無統(tǒng)計學意義(t=-1.525,P=0.139)。 ③根據(jù)新生兒血清中乙肝標志物的檢測結(jié)果將新生兒分為HBV宮內(nèi)感染組和非HBV宮內(nèi)感染組,新生兒HBV宮內(nèi)感染組TLR3 mRNA高于非HBV宮內(nèi)感染組,差別有統(tǒng)計學意義(t=2.613,P=0.015)。 3.人群TLR3 mRNA與IL-2、6分泌的關(guān)系 ①HBsAg陽性孕婦血清中IL-2的濃度(32.95±9.93pg/ml)比正常孕婦(27.65±2.86pg/ml)高,而IL-6濃度(52.35±22.09pg/ml)較正常孕婦(544.6±615.4pg/ml)低,差別均有統(tǒng)計學意義(t=-2.291,P=0.028;t=3.575,P=0.002),并且以IL-2代表Th1型細胞因子,IL-6代表Th2型細胞因子計算Th1/Th2比值,HBsAg陽性孕婦組Th1/Th2(0.22±0.25)比正常孕婦組(0.71±0.27)小,差別具有統(tǒng)計學意義(t=-5.86,P＜0.05)。 ②HBsAg陽性孕婦的HBV宮內(nèi)感染組血清中IL-6濃度(81.003±21.64pg/ml)高于非HBV宮內(nèi)感染組(42.80±11.7 pg/ml),差別具有統(tǒng)計學意義(t=-3.77,P=0.014)。Th1/Th2比值(0.43±0.13)低于非HBV宮內(nèi)未感染組(0.80±0.24),差別具有統(tǒng)計學意義(t=3.334,P=0.004)。 ③以TLR3/β-actin Ct值與相應標本的IL-2,6的濃度作相關(guān)分析,得出TLR3/β-actin Ct值與IL-2的濃度呈負相關(guān)關(guān)系,r=-0.56,P＜0.05,隨著TLR3的增加,IL-2分泌增加。而未發(fā)現(xiàn)與IL-6有相關(guān)性,r=0.096,P＞0.05。 4.HBV體外刺激正常孕婦PBMC TLR3的表達及與細胞因子分泌的關(guān)系 ①正常孕婦PBMC TLR3的表達在HBV刺激組與正常對照組差異有統(tǒng)計學意義(t=-2.36,P=0.029),但對培養(yǎng)2、4、6天PBMC TLR3 mRNA的表達量進行比較,差別無統(tǒng)計學意義(F=0.045,P=0.965)。 ②正常孕婦PBMC培養(yǎng)上清中IL-2、TNF-α在HBV刺激組濃度增加,與正常對照組相比差別有統(tǒng)計學意義(t=2.415,P=0.023;t=2.277,P=0.031)。IL-6、10、12和IFN-γ濃度,Th1/Th2(IL-2/IL-6)比值在HBV刺激組有所增加,但差別無統(tǒng)計學意義。TLR3/β-actinCt值與IL-10,IL-6,IFN-γ呈負相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r分別為-0.331(P=0.043),-0.46(P=0.014),-0.557(P=0.025),隨著TLR3的活化增多,其濃度增加。各個細胞因子之間的關(guān)系IL-12與IFN-γ,IL-2呈正相關(guān)關(guān)系,r分別為0.588(P=0.027),0.475(P=0.014),與IL-10呈負相關(guān)關(guān)系,r=-0.752(P=0.001)。IL-10與IFN-γ呈負相關(guān)關(guān)系,r=-0.633,(P=0.006),TNF-α和IL-6呈負相關(guān)關(guān)系,r=-0.467(P=0.019),IFN-γ和IL-6呈負相關(guān)關(guān)系,r=-0.507(P=0.045)。 5.RNAi沉默TLR3和PolyI:C活化TLR3后對HBV感染的影響 ①RNAi技術(shù)對PBMC TLR3 mRNA的抑制效率為67.83%,正常人PBMC在HBV刺激,RNAi,PolyI:C刺激后和正常對照組的TLR3 mRNA,蛋白表達四組相比有統(tǒng)計學意義(F=5.33,4.89;P=0.018,0.031)。PolyI:C刺激24h后TLR3顯著增高,RNAi48h后TLR3顯著降低。 ②RNAi 48h可以下調(diào)TLR3 mRNA和TLR3蛋白,且在干擾后加HBV刺激繼續(xù)培養(yǎng)6天TLR3 mRNA隨刺激時間的延長總體有回升的趨勢,在第四天TLR3 mRNA增加到最大,之后又有所下降。TLR3蛋白也隨時間的延長表達增加,開始時增加緩慢,在第五天達到最高。 ③PolyI:C刺激24小時后TLR3 mRNA和TLR3蛋白顯著增加,且在加HBV繼續(xù)培養(yǎng)5天,TLR3 mRNA隨刺激時間的延長繼續(xù)增加,在第二天TLR3 mRNA增加到最大,第三天又開始下降。但TLR3蛋白在加入HBV刺激1天時,表達減少,后又逐漸增加。 ④正常人的PBMC與HBV共培養(yǎng),在第4,6天PBMC中檢出了HBV DNA,且培養(yǎng)上清和PBMC中HBV DNA的拷貝數(shù)在第6天有所下降,但在培養(yǎng)2、4、6天后培養(yǎng)上清中、PBMC中HBV DNA的拷貝數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(F=1.24,1.83,P=0.489,0.397)。 ⑤PolyI:C刺激24h后加HBV共培養(yǎng),在第4天PBMC中檢出了HBV DNA。在培養(yǎng)上清和PBMC中HBV DNA含量隨時間的延長明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(F=6.34,7.01,P=0.036,0.027)。 ⑥RNAi 48h后加HBV共培養(yǎng)在第2天,第6天PBMC中檢出了HBV DNA。在培養(yǎng)上清中HBV DNA含量隨時間的延長有增高的趨勢,但在統(tǒng)計學上差異無顯著性(F=2.34,P＞0.05)。在PBMC中HBV DNA含量隨時間的延長有顯著增高,差異有統(tǒng)計學意義(F=4.67,P=0.042)。 結(jié)論1.TLR3在PBMC有表達,在PBMC不同細胞上表達強度不同。在TLR3表達強的細胞上HBsAg表達弱或無表達。 2.TLR3與HBV感染有關(guān),HBV陽性的PBMC TLR3低表達,TLR3是PBMC HBV感染的保護因素;以新生兒PBMC HBV感染判為新生兒PBMC HBV宮內(nèi)感染,母親TLR3蛋白是新生兒PBMC HBV宮內(nèi)感染的保護因素。以新生兒血清HBV標志物HBsAg,HBV DNA任一陽性定義新生兒HBV宮內(nèi)感染,母親PBMC TLR3表達與新生兒HBV宮內(nèi)感染無統(tǒng)計學關(guān)聯(lián),但新生兒PBMC TLR3表達是新生兒HBV宮內(nèi)感染的保護因素。 3.TLR3與Th1細胞因子的分泌呈正相關(guān)關(guān)系,TLR3可能通過增加細胞因子的分泌參與HBV的清除過程。 4.以HBV刺激正常孕婦PBMC可使PBMC TLR3 mRNA和TLR3蛋白表達上調(diào),IL-10,IL-6,IFN-γ隨著TLR3的上調(diào)而分泌增加,而TNF-α,IL-2分泌增加顯著,說明HBV感染PBMC以啟動Th1型免疫反應為主。 5.RNAi后TLR3在蛋白水平和基因水平上有所降低,一定程度上增加了PBMC對HBV的易感染性。PolyI:C刺激后TLR3在蛋白水平和基因水平上有所升高,并一定程度上降低了PBMC對HBV的易感染性。TLR3可一定程度上影響HBV的復制增殖。 6.可以考慮將TLR3作為乙型肝炎治療性疫苗或佐劑及輔助性治療藥物的作用靶點來開發(fā)應用。
【圖文】：

山西醫(yī)科大學博士論文圖1一1免疫熒光雙標記術(shù)檢測 PBMCTLR3，綠色熒光顯示TLRTLR3存在于細胞胞膜強表達 X400圖1一2免疫熒光雙標記術(shù)檢測 PBMcHBsAg，無紅色熒光。X400

圖1一1免疫熒光雙標記術(shù)檢測 PBMCTLR3，，綠色熒光顯示TLRTLR3存在于細胞胞膜強表達 X400圖1一2免疫熒光雙標記術(shù)檢測 PBMcHBsAg，無紅色熒光。X400
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R512.62;R714.2

【引證文獻】

相關(guān)碩士學位論文 前3條

1 胡婷;TLR3與胎盤細胞凋亡在胎盤HBV感染及HBV宮內(nèi)感染中的作用[D];山西醫(yī)科大學;2010年

2 閻娟娟;TLR3及其相關(guān)細胞因子在Bewo細胞抗HBV感染中的作用[D];山西醫(yī)科大學;2010年

3 劉明慧;TLR3在HBsAg陽性孕婦嬰兒HBV宮內(nèi)感染中作用機制的研究[D];山西醫(yī)科大學;2012年

本文編號：2703307