【摘要】： 哺乳動物肝臟具有非常強大的再生能力。通常情況下,人的肝臟在受損后,3天內(nèi)啟動肝再生,2-3周后可以基本恢復肝臟功能,3-6個月后肝臟可恢復到與受損前一樣大小。肝臟再生是一個復雜的過程,成千上萬的物質參與了這個過程。 近兩年,我們實驗室的研究人員利用傳統(tǒng)的生化分離與現(xiàn)代蛋白質組學相結合的分離方法從新生小牛肝臟中分離到一個能夠特異的促進肝細胞增殖的蛋白因子,將其命名為HPPCn(hepatopoietin Cn, HPPCn)。隨后,又從人胎肝cDNA文庫中篩到了它的人源序列。 生物活性分析顯示,重組人HPPCn蛋白能夠特異地促進原代培養(yǎng)大鼠肝細胞、正常肝細胞系L02和肝癌細胞系SMMC7721的DNA合成和細胞分裂,而且能夠促進70%肝臟切除小鼠的肝再生,初步的動物實驗顯示重組HPPCn蛋白對乙醇誘導的急性肝損傷有明顯的保護作用。 序列分析顯示,HPPCn與富含亮氨酸的酸性核蛋白(Leucine-rich acidic nuclear protein,LANP)家族其他成員序列同源性達到70%以上,且同已知的LANP蛋白一樣,具有保守并且特殊的結構特征:1)其N端含有一個由25個亮氨酸組成的高度重復序列,稱之為富含亮氨酸重復序列(leucine rich-repeats,LRRs),它具有特征性的βαβ的馬靴型結構,有利于蛋白與蛋白之間的相互作用;2)C端第169-230位的氨基酸殘基是一段由谷氨酸與天冬氨酸組成的重復序列,稱之為酸性尾結構(acidic tail domain),這有利于它們在核內(nèi)與染色體相結合,從而調控基因的轉錄。 蛋白質結構分析顯示,HPPCn擁有核蛋白的結構特點,但是它又不具有典型的信號肽結構,那么它是如何作為一個生長因子來發(fā)揮作用的呢?在已有的報道中,相當數(shù)量的核蛋白(如HMGB1,HDGF等)能夠同時在細胞內(nèi)外發(fā)揮作用,屬于一類可在核內(nèi)外同時發(fā)揮作用的雙功能細胞因子。HPPCn與其有極其相似的結構,這種結構的相似性,能否產(chǎn)生功能的相似性?即HPPCn是否具有能在細胞內(nèi)外同時發(fā)揮作用的雙功能性?前期的實驗表明,FITC標記的重組HPPCn蛋白與肝細胞表面呈斑塊樣特異性結合,并能激活細胞中增殖相關的激酶活性,如SPK,MAPK,STAT3。流式分析顯示,不論是結合實驗還是競爭性抑制實驗,均表明HPPCn能夠與肝細胞特異結合。 本研究主要目的是尋找HPPCn相互作用的的膜蛋白。我們首先制備了攜帶His標簽的HPPCn蛋白,并利用改進的His Pull-down的方法尋找HPPCn相互作用的膜蛋白,通過免疫共沉淀,轉染細胞等方式對他們的相互作用做了進一步驗證。具體的實驗方法如下: 首先,表達純化帶His標簽的HPPCn蛋白并分離肝癌細胞系SMMC7721的膜蛋白。構建帶His標簽的HPPCn的原核表達載體pET-24a(+)-HPPCn,并將其轉入大腸桿菌BL21,構建表達帶His標簽的HPPCn重組蛋白的工程菌,利用工程菌發(fā)酵生產(chǎn)大量帶His標簽的HPPCn蛋白,并通過Q-XL陰離子交換層析和His親和層析進行蛋白純化。通過蔗糖密度梯度離心的方法獲得肝癌細胞系SMMC7721的膜蛋白。 第二,通過改進的His Pull-down方法,尋找HPPCn相互作用的膜蛋白。將光敏感交聯(lián)劑SANPAH、帶His標簽的HPPCn蛋白與提取的膜表面蛋白一起用紫外照射,由于化學鍵的斷裂重新連接,帶His標簽的HPPCn蛋白與提取的膜表面蛋白進行交聯(lián),超速離心分離交聯(lián)復合物。His親和層析進一步純化交聯(lián)復合體,得到帶His標簽的HPPCn蛋白和交聯(lián)復合體的混合物, SDS-PAGE電泳對其進行分離,并進一步通過Western blot用抗His的抗體和抗HPPCn的抗體對分離的條帶進行專一性鑒定,與相應的SDS-PAGE電泳結果比對找到目的條帶,割膠回收,質譜鑒定。 最后,進一步驗證HPPCn與角蛋白8/18之間的相互作用。我們首先用角蛋白8/18抗體通過細胞免疫組化的方式,對SMMC7721細胞表面的角蛋白8/18的分布進行分析。通過細胞外的結合實驗和免疫共沉淀進一步確定兩者之間的相互作用。為了在細胞內(nèi)確定HPPCn與角蛋白8/18相互作用的存在,將角蛋白8/18的表達載體pCDNA3.1-K8-IRES-K18轉入HPPCn作用陰性的小鼠成纖維細胞系NIH-3T3,篩選穩(wěn)定表達株,觀察HPPCn對其是否有促增殖抗凋亡的活性。 實驗結果顯示,通過不同濃度IPTG,不同誘導時間誘導,最后確定0.3mM IPTG,誘導4小時,工程菌可以大量表達帶His標簽的HPPCn,因此表達帶His標簽的HPPCn的工程菌構建成功。大量搖瓶培養(yǎng),收集菌體超聲破碎,得到的超聲上清經(jīng)過Q-XL陰離子交換層析和His親和層析,去除大部分雜蛋白,獲得較為純凈的帶His標簽的HPPCn,灰度掃描純度達到90%以上,符合后續(xù)實驗的要求。通過蔗糖密度梯度離心的方法逐級分離大量的肝癌細胞系SMMC7721的膜蛋白,為后續(xù)兩者的相互作用奠定基礎。通過改進的His Pull-down和質譜相結合,篩選到HPPCn相互作用的膜蛋白角蛋白8/18。免疫組化實驗確定了角蛋白8/18在膜表面的分布,PVDF膜上的蛋白結合實驗和免疫共沉淀結果驗證了HPPCn與角蛋白8/18的相互作用。通過角蛋白8穩(wěn)定轉染株的初步實驗發(fā)現(xiàn)HPPCn對轉化了pCDNA3.1-K8表達載體的NIH-3T3細胞系促增殖作用不太明顯。 角蛋白8/18是正常成年人肝細胞中唯一的中間纖維蛋白。越來越多的實驗發(fā)現(xiàn),角蛋白8/18不僅能夠對抗機械壓力,而且可以對抗各種毒素壓力以及Fas介導的細胞凋亡。而臨床數(shù)據(jù)顯示,角蛋白8/18特定氨基酸殘基的突變將會導致各種肝臟疾病。分子機制研究發(fā)現(xiàn),角蛋白8/18一方面可以與各種骨架相互蛋白作用維持細胞形態(tài),另一方面與各種激酶、接頭蛋白和細胞凋亡蛋白相互作用構成復雜的信號通路系統(tǒng)。因此角蛋白8/18在研究肝臟細胞對抗毒素壓力,細胞凋亡以及各種肝臟疾病方面有重要的意義。 本研究通過His Pull-down的方法獲得與HPPCn相互作用的膜蛋白角蛋白8/18,并通過進一步的免疫共沉淀等體外驗證實驗初步證實了兩者的相互作用。構建了角蛋白8/18的真核表達載體,轉染HPPCn作用陰性的NIH-3T3細胞。角蛋白8的單獨表達解除了HPPCn對NIH-3T3細胞生長的抑制作用。
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新的肝細胞刺激因子。由于 HPPCn 結構的獨特性，子，一方面在核定位信號作用下，進入核內(nèi)發(fā)揮其轉特定的條件下，通過某一種特殊途徑分泌或釋放到細體蛋白結合，發(fā)揮其促增殖活性。為了尋找 HPPCn構建了帶 His 標簽的 HPPCn（His-HPPCn）的-His-HPPCn 質粒，并將其轉化到大腸桿菌 BL21（DE His 標簽的 HPPCn 工程菌。通過 IPTG 誘導，大量表過 Q-XL 陰離子親和層析和 His 親和層析得到較為純 膜蛋白的分選是通過密度梯度離心的方式獲得的。材料質粒載體 標簽的原核表達載體 pET-24a(＋)載體由本實驗室保存

加入超速離心管內(nèi)，上層用 C 液填滿，70000 g 離心 6精細提取，用 C 液重新溶解中間層，，后加入適當?shù)?D溶液，上層用 C 液填滿，23000 g 離心 60 min。收集中洗滌，吸取中間層液體，用 PBS 重懸，18000 g 超速離重懸，用 PBS+1% NP-40+1%CHAPS 重懸，輕微超聲 實驗結果工程菌BL21(DE3)-pET-24a (+)-His-HPPCn鑒定結果工程菌 BL21(DE3)-pET-24a (+)-His-HPPCn 為實驗室已，為確認該菌株的可靠性，提取質粒，對其進行了酶(1) 酶切鑒定結果圖 1-1 所示，經(jīng) XhoI 和 NotI 雙酶切，1.2 %瓊脂糖凝。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R575

【參考文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 張達矜;新的肝細胞生長因子（HPPCn）生物活性及作用機制的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2007年

相關碩士學位論文 前1條

1 杜劭君;一種新的肝再生刺激因子HPPCn的克隆、表達、分離純化及其生物活性的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2006年

本文編號：2700779