【摘要】：目的:1.比較嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌、酪酸梭菌、地衣芽孢桿菌、保加利亞乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌對胃粘膜上皮細胞的體外粘附能力、對胃上皮細胞的毒性作用以及對幽門螺桿菌標準株ATCC43504及臨床分離多重耐藥株粘附胃粘膜上皮細胞的影響。2.比較嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌、酪酸梭菌、地衣芽孢桿菌、保加利亞乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌活菌及不同PH值發(fā)酵上清液對幽門螺桿菌的抑菌作用。3.篩選出體外具有較強抑制幽門螺桿菌粘附胃粘膜上皮細胞能力的益生菌,評價該益生菌對幽門螺桿菌脂多糖(LPS)誘導胃粘膜上皮細胞分泌IL-8的影響。4.評價該益生菌對幽門螺桿菌脂多糖誘導的胃粘膜上皮細胞TLR4、總NF-κBp65、細胞核NF-κBp65、IκBα、p-IκBα表達量的影響,初步探討益生菌調節(jié)局部胃粘膜炎癥反應的機制。研究方法:1.分離培養(yǎng)嗜酸乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、唾液乳桿菌、地衣芽孢桿菌和酪酸梭菌,采用胃正常上皮細胞GES-1細胞系作為體外細胞模型,用革蘭氏染色法評估以上7種益生菌菌株的胃粘膜上皮粘附能力,用臺盼藍染色法檢測益生菌對胃上皮細胞活力的影響;2.提取嗜酸乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、唾液乳桿菌、地衣芽孢桿菌和酪酸梭菌的發(fā)酵液,測定PH值。從萎縮性胃炎患者胃粘膜分離出多重耐藥HP,對比HP ATCC43504標準菌株,用瓊脂平板打孔法檢測這7種益生菌活菌及不同PH值發(fā)酵液對兩種HP菌株生長的影響;通過尿素-酚紅試驗分別觀察益生菌預處理和后處理對兩種HP菌株粘附GES-1細胞的抑制作用;3.提取HP ATCC43504標準株的LPS,測定LPS濃度;通過第一部分篩選出可有效粘附于GES-1細胞的益生菌,用ELISA和RT-PCR方法分別檢測益生菌活菌是否可抑制HP-LPS誘導GES-1細胞產(chǎn)生IL-8炎癥因子;4.選擇可抑制HP-LPS誘導GES-1產(chǎn)生IL-8的益生菌,用細胞免疫組化方法檢測益生菌對GES-1細胞在HP-LPS作用下細胞膜TLR_4表達量和NF-κBp65轉核情況;用Western blotting方法半定量檢測細胞膜TLR_4,細胞漿IκBα、p-IκBα,總NF-κB p65、細胞核內NF-κB p65表達量,初步探討益生菌調節(jié)HP-LPS所致胃粘膜炎癥的作用機制。結果:1.革蘭氏染色后油鏡下可見益生菌粘附于GES-1細胞,不同益生菌粘附指數(shù)有差異,益生菌對細胞粘附指數(shù)與對細胞粘附率結果一致:嗜酸乳桿菌保加利亞乳桿菌嬰兒雙歧桿菌長雙歧桿菌唾液乳桿菌地衣芽孢桿菌酪酸梭菌。2.嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、唾液乳桿菌、酪酸梭菌、長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌在MOI=1:100時,4h內對細胞無明顯毒性作用,4h細胞存活率平均在97%以上,組間無統(tǒng)計學差異。4h后益生菌開始對細胞活性產(chǎn)生影響,細胞存活率逐漸下降,長雙歧桿菌下降最為明顯,6h細胞平均存活率為92.0%,地衣芽孢桿菌下降最慢,6h細胞平均存活率為99.7%。8h后細胞存活率進一步下降,保加利亞乳桿菌組在6—8h內細胞存活率下降幅度最大,8h細胞平均存活率為82.3%。MOI=1:1000時,2h內益生菌對細胞無明顯毒性作用,組間無統(tǒng)計學差異,2h后細胞存活率開始下降,保加利亞乳桿菌組細胞存活率下降最明顯,4h為10.4%,6h時已全部死亡。地衣芽孢桿菌較其它乳酸桿菌組細胞存活率下降慢,6h仍有95.3%細胞存活,在6h后細胞存活率開始下降,8h細胞存活率為42.7%,其余乳酸桿菌組8h細胞全部死亡。3.嗜酸乳桿菌、酪酸梭菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、唾液乳桿菌、保加利亞乳桿菌菌懸液均可以抑制HP多重耐藥株和HP ATCC43504標準株的生長,地衣芽孢桿菌菌懸液對HP多重耐藥株及標準株均無抑制作用。保加利亞乳桿菌組、地衣芽孢桿菌組和其它組均有統(tǒng)計學差異(P0.05),唾液乳桿菌、長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、酪酸梭菌四組組間無統(tǒng)計學差異。嗜酸乳桿菌、酪酸梭菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、唾液乳桿菌、保加利亞乳桿菌上清液在PH值≤3時對HP有抑制作用,地衣芽孢桿菌的上清液對HP有生長抑制作用,且不依賴于PH值。4.GES-1細胞經(jīng)過嗜酸乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、唾液乳桿菌預處理2h后,HP的粘附率下降,嗜酸乳桿菌組抑制作用最明顯(P0.05)。益生菌對HP粘附GES-1細胞的抑制能力:嗜酸乳桿菌保加利亞乳桿菌嬰兒雙歧桿菌長雙歧桿菌唾液乳桿菌。由于酪酸梭菌和地衣芽孢桿菌菌體本身不能粘附于GES-1細胞,因此不能減少HP的粘附率。益生菌后處理組,HP胃細胞粘附率未見下降。5.在HP-LPS的刺激下,GES-1細胞分泌的IL-8量明顯增高,是空白對照組的近10倍,預先與保加利亞乳桿菌、唾液乳桿菌作用2h后,GES-1細胞IL-8的分泌量較HP-LPS減少,保加利亞乳桿菌組作用最明顯,IL-8分泌量減少了50%左右(P0.05)。嗜酸乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌預作用組IL-8分泌量較HP-LPS組略升高,無降低IL-8的作用。6.正常生理情況下,GES-1細胞核內很少表達NF-κB p65,胞膜上有少量TLR4表達,胞漿內有大量IκBα表達,當受到HP-LPS刺激60min后,胞漿內NF-κB p65開始轉移至細胞核內,TLR_4和p-IκBα表達增多,IκBα降解(P0.05),3.0*10~(^7)cfu/ml保加利亞乳桿菌預作用細胞2h后,NF-κB p65轉核量減少(P0.05),TLR_4表達量減少(P0.05),p-IκBα表達減少,IκBα降解量減少(P0.05)。結論:1.嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌對胃粘膜上皮細胞有較好的粘附性;在一定濃度內(MOI=100)4h對胃上皮細胞活力沒有影響。2.嗜酸乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、酪酸梭菌、唾液芽孢桿菌的活菌和發(fā)酵液在PH值≤3時對HP多重耐藥株和HP標準株均有一定的生長抑制作用,抑菌物質考慮為有機酸,地衣芽孢桿菌活菌沒有抑制作用,發(fā)酵液有明顯的抑制作用且與PH值無關。3.嗜酸乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌、唾液乳桿菌可預先占據(jù)胃上皮細胞粘附位點,減少HP的粘附,但HP粘附于細胞后,益生菌不能將HP排擠出。4.保加利亞乳桿菌可以通過TLR4-NF-κB途經(jīng)減少HP-LPS誘發(fā)的GES-1細胞IL-8的生成。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學博士學位論文3.1.7 唾液乳桿菌唾液乳桿菌厭氧生長，平板生長形態(tài)（圖 3.1.13）：菌落圓形凸起，乳白色，光滑，有光澤，直徑 1—2mm，挑起托絲粘稠。革蘭氏染色（圖 3.1.14）革蘭氏陽性，呈短桿狀，二端呈圓形，通常單獨出現(xiàn)，成對短鏈狀，，無莢膜無芽孢，無鞭毛，不運動。

中國醫(yī)科大學博士學位論文3.1.7 唾液乳桿菌唾液乳桿菌厭氧生長，平板生長形態(tài)（圖 3.1.13）：菌落圓形凸起，乳白色，光滑，有光澤，直徑 1—2mm，挑起托絲粘稠。革蘭氏染色（圖 3.1.14）革蘭氏陽性，呈短桿狀，二端呈圓形，通常單獨出現(xiàn)，成對短鏈狀，無莢膜無芽孢，無鞭毛，不運動。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R573

【參考文獻】

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本文編號：2698987