【摘要】：目的： HMGB1是近年發(fā)現(xiàn)在多種病毒性疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用的細(xì)胞因子之一，但其在HBV感染中的作用仍未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究擬首先通過(guò)檢測(cè)HMGB1在HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)水平了解其在HBV感染中的表達(dá)情況，然后通過(guò)加入外源性HMGB1刺激HepG2.2.15細(xì)胞，檢測(cè)HBVDNA、HBsAg和HBeAg的表達(dá)變化，以探討HMGB1在HBV復(fù)制中的作用，為進(jìn)一步研究乙肝發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。 方法： 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Westernblot法從基因水平和蛋白水平檢測(cè)HMGB1在HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)情況；分別以不含HMGB1培養(yǎng)基（control組）及含HMGB1培養(yǎng)基（100μg/LHMGB1刺激組）體外培養(yǎng)HepG2.2.15細(xì)胞0、12、24、36、48、72和96h，用雅培化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)HBSAg、HBeAg的表達(dá)，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HBVDNA的表達(dá)。 結(jié)果： HMGB1基因和蛋白在HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中均有表達(dá)，且在HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于HepG2細(xì)胞；HMGB1刺激后24-96hHBVDNA、HBsAg和HBeAg的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，與0h相比均有顯著性差異（p0.05或p0.01），，且與control組相比，亦有顯著性差異（p0.01）。 結(jié)論： HMGB1在HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)高于HepG2細(xì)胞，說(shuō)明HMGB1與HBV感染有關(guān)；HMGB1體外刺激HepG2.2.15細(xì)胞能增強(qiáng)HBVDNA、HBsAg和HBeAg的分泌，促進(jìn)HBV復(fù)制；HMGB1持續(xù)刺激可使HBV復(fù)制更活躍，可能是導(dǎo)致HBV持續(xù)復(fù)制的關(guān)鍵因素之一。 目的： 第一部分研究表明HMGB1體外刺激HepG2.2.15細(xì)胞能夠促進(jìn)HBV復(fù)制，但具體分子機(jī)制不明。本研究擬通過(guò)HMGB1體外刺激HepG2.2.15細(xì)胞后檢測(cè)toll樣信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子及HNF4α的表達(dá),初步探索HMGB1促進(jìn)HBV復(fù)制的可能機(jī)制，為臨床乙肝治療提供新的靶點(diǎn)。 方法： 100μg/LHMGB1刺激HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)0、12、24、36、48、72和96h，用流式法測(cè)細(xì)胞表面TLR2、TLR4的表達(dá)；用Westernblot法測(cè)Myd88、JNK、ERK、p38MAPK和NF-κB蛋白水平的變化；用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblot測(cè)HNF4α的表達(dá)變化；用細(xì)胞免疫化學(xué)、共聚焦顯微鏡觀察NF-κB、HNF4α含量變化。 結(jié)果： 流式結(jié)果表明TLR2、TLR4在HepG2.2.15細(xì)胞中均有表達(dá)，且TLR4表達(dá)顯著性高于TLR2，HMGB1刺激HepG2.2.15細(xì)胞后，TLR2表達(dá)無(wú)明顯變化，TLR4的表達(dá)于12-96h呈現(xiàn)為高表達(dá)；Westernblot結(jié)果提示Myd88、JNK、ERK、p38MAPK和NF-κB在蛋白水平于HMGB1刺激0h均表達(dá)較弱，HMGB1刺激后表達(dá)均逐漸增強(qiáng)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblot結(jié)果提示HMGB1刺激HepG2.2.15細(xì)胞后，HNF4α基因水平和蛋白水平表達(dá)均隨刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)增強(qiáng)，并于48-96h呈顯著性升高，實(shí)時(shí)熒光定量PCR與Westernblot程度趨于一致；免疫熒光、激光共聚焦結(jié)果顯示NF-κB在HepG2.2.15細(xì)胞中于HMGB1刺激后12-48h由胞漿逐漸轉(zhuǎn)位至胞核，HNF4α的表達(dá)在HepG2.2.15細(xì)胞主要位于胞核，HMGB1刺激HepG2.2.15細(xì)胞后，綠色熒光隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)熒光亮度增強(qiáng)。結(jié)論： HMGB1在HepG2.2.15細(xì)胞中信號(hào)通路主要由TLR4介導(dǎo)；HMGB1體外刺激HepG2.2.15細(xì)胞能夠上調(diào)HNF4α的表達(dá)，且上調(diào)的HNF4α與HBVDNA的表達(dá)呈正相關(guān)；HMGB1可以通過(guò)TLR4-MyD88-MAPK-NF-κB通路上調(diào)HNF4α，促進(jìn)HBV復(fù)制。
【圖文】：

（圖 1 ）。用 分光 光 度計(jì) 測(cè) 得各 組 總 R NA OD 2 6 0/ OD 2 8 0 比值 均在 1. 8 -2 . 0 之間 ，表 明總 R NA 提取 質(zhì) 量 好， 可 以 作 為 re a l -t i m e P C R 反應(yīng) 模 板 進(jìn) 行擴(kuò) 增 。 圖1提 取的 總R N A瓊 脂糖 凝 膠 電泳 圖Fi g 1 A g a ro s e e le c tr o p h o re s is o f to t a l mR N A e x t r a c te d3. 1 . 2 H ep G2 和 H ep G2 .2 . 15 細(xì) 胞中 H MG B 1 mR NA 的 表達(dá) 變 化 抽 提 He p G 2 和 He p G2 . 2. 1 5 細(xì) 胞 總 R NA 進(jìn) 行 re a l -t i m e RT - P C R 擴(kuò) 增 ， 結(jié) 果 顯示 HM BG 1 m R NA 在 He p G 2 . 2 .1 5 細(xì)胞 中 顯著 性 高 于 He p G 2 細(xì)胞 （ p< 0 .0 1 ，圖 2 、3 、 4） 。

圖2 H MG B 1的 擴(kuò) 增 曲線(xiàn) Fi g 2 A mp li f ic a t io n c ur v e fo r re a l- t im e PC R pr o du c ts 1 2H MG B1 G A PD H1：H e pG 2 . 2 . 1 5細(xì) 胞； 2：H e pG 2細(xì) 胞圖3定 量PC R產(chǎn) 物的 電泳 檢測(cè) Fi g 3 El e c tr o ph o re s is a na ly s is o f th e re a l- t im e RT - P C R pr o du c ts
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

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1 韓紅莉;趙中夫;楊柳絮;盧俊敏;常蘊(yùn)青;吳紅樣;;高遷移率族蛋白B1在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用研究[J];長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2008年05期

2 陳若蟬;黃燕;周蓉蓉;易盼盼;范學(xué)工;;高遷徙率族蛋白B1和糖基化終產(chǎn)物受體與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系[J];中國(guó)肝臟病雜志(電子版);2011年04期

3 高珍;張倫理;;Toll樣受體介導(dǎo)的抗乙型肝炎病毒的固有免疫[J];臨床肝膽病雜志;2011年06期

4 王敏;范學(xué)工;黃維亮;徐丹;;HIV感染者/AIDS病人高遷移率族蛋白1的表達(dá)及其臨床意義[J];生命科學(xué)研究;2009年06期

5 彭建平;范學(xué)工;劉洪波;;慢性乙型肝炎患者高遷移率族蛋白1mRNA的表達(dá)及其臨床意義[J];世界華人消化雜志;2006年02期

本文編號(hào)：2698262