發(fā)布時間：2020-06-05 15:45

【摘要】：目的： HMGB1是近年發(fā)現(xiàn)在多種病毒性疾病的發(fā)病機制中起重要作用的細胞因子之一，但其在HBV感染中的作用仍未見相關(guān)報道。本研究擬首先通過檢測HMGB1在HepG2.2.15細胞中的表達水平了解其在HBV感染中的表達情況，然后通過加入外源性HMGB1刺激HepG2.2.15細胞，檢測HBVDNA、HBsAg和HBeAg的表達變化，以探討HMGB1在HBV復(fù)制中的作用，為進一步研究乙肝發(fā)病機制提供理論依據(jù)。 方法： 用實時熒光定量PCR法和Westernblot法從基因水平和蛋白水平檢測HMGB1在HepG2和HepG2.2.15細胞中的表達情況；分別以不含HMGB1培養(yǎng)基（control組）及含HMGB1培養(yǎng)基（100μg/LHMGB1刺激組）體外培養(yǎng)HepG2.2.15細胞0、12、24、36、48、72和96h，用雅培化學(xué)發(fā)光法檢測HBSAg、HBeAg的表達，用實時熒光定量PCR法檢測HBVDNA的表達。 結(jié)果： HMGB1基因和蛋白在HepG2和HepG2.2.15細胞中均有表達，且在HepG2.2.15細胞中的表達明顯高于HepG2細胞；HMGB1刺激后24-96hHBVDNA、HBsAg和HBeAg的表達逐漸增強，與0h相比均有顯著性差異（p0.05或p0.01），，且與control組相比，亦有顯著性差異（p0.01）。 結(jié)論： HMGB1在HepG2.2.15細胞中的表達高于HepG2細胞，說明HMGB1與HBV感染有關(guān)；HMGB1體外刺激HepG2.2.15細胞能增強HBVDNA、HBsAg和HBeAg的分泌，促進HBV復(fù)制；HMGB1持續(xù)刺激可使HBV復(fù)制更活躍，可能是導(dǎo)致HBV持續(xù)復(fù)制的關(guān)鍵因素之一。 目的： 第一部分研究表明HMGB1體外刺激HepG2.2.15細胞能夠促進HBV復(fù)制，但具體分子機制不明。本研究擬通過HMGB1體外刺激HepG2.2.15細胞后檢測toll樣信號通路相關(guān)信號分子及HNF4α的表達,初步探索HMGB1促進HBV復(fù)制的可能機制，為臨床乙肝治療提供新的靶點。 方法： 100μg/LHMGB1刺激HepG2.2.15細胞培養(yǎng)0、12、24、36、48、72和96h，用流式法測細胞表面TLR2、TLR4的表達；用Westernblot法測Myd88、JNK、ERK、p38MAPK和NF-κB蛋白水平的變化；用實時熒光定量PCR、Westernblot測HNF4α的表達變化；用細胞免疫化學(xué)、共聚焦顯微鏡觀察NF-κB、HNF4α含量變化。 結(jié)果： 流式結(jié)果表明TLR2、TLR4在HepG2.2.15細胞中均有表達，且TLR4表達顯著性高于TLR2，HMGB1刺激HepG2.2.15細胞后，TLR2表達無明顯變化，TLR4的表達于12-96h呈現(xiàn)為高表達；Westernblot結(jié)果提示Myd88、JNK、ERK、p38MAPK和NF-κB在蛋白水平于HMGB1刺激0h均表達較弱，HMGB1刺激后表達均逐漸增強；實時熒光定量PCR、Westernblot結(jié)果提示HMGB1刺激HepG2.2.15細胞后，HNF4α基因水平和蛋白水平表達均隨刺激時間的延長而表達增強，并于48-96h呈顯著性升高，實時熒光定量PCR與Westernblot程度趨于一致；免疫熒光、激光共聚焦結(jié)果顯示NF-κB在HepG2.2.15細胞中于HMGB1刺激后12-48h由胞漿逐漸轉(zhuǎn)位至胞核，HNF4α的表達在HepG2.2.15細胞主要位于胞核，HMGB1刺激HepG2.2.15細胞后，綠色熒光隨刺激時間延長熒光亮度增強。結(jié)論： HMGB1在HepG2.2.15細胞中信號通路主要由TLR4介導(dǎo)；HMGB1體外刺激HepG2.2.15細胞能夠上調(diào)HNF4α的表達，且上調(diào)的HNF4α與HBVDNA的表達呈正相關(guān)；HMGB1可以通過TLR4-MyD88-MAPK-NF-κB通路上調(diào)HNF4α，促進HBV復(fù)制。
【圖文】：

（圖 1 ）。用 分光 光 度計 測 得各 組 總 R NA OD 2 6 0/ OD 2 8 0 比值 均在 1. 8 -2 . 0 之間 ，表 明總 R NA 提取 質(zhì) 量 好， 可 以 作 為 re a l -t i m e P C R 反應(yīng) 模 板 進 行擴 增 。 圖1提 取的 總R N A瓊 脂糖 凝 膠 電泳 圖Fi g 1 A g a ro s e e le c tr o p h o re s is o f to t a l mR N A e x t r a c te d3. 1 . 2 H ep G2 和 H ep G2 .2 . 15 細 胞中 H MG B 1 mR NA 的 表達 變 化 抽 提 He p G 2 和 He p G2 . 2. 1 5 細 胞 總 R NA 進 行 re a l -t i m e RT - P C R 擴 增 ， 結(jié) 果 顯示 HM BG 1 m R NA 在 He p G 2 . 2 .1 5 細胞 中 顯著 性 高 于 He p G 2 細胞 （ p< 0 .0 1 ，圖 2 、3 、 4） 。

圖2 H MG B 1的 擴 增 曲線 Fi g 2 A mp li f ic a t io n c ur v e fo r re a l- t im e PC R pr o du c ts 1 2H MG B1 G A PD H1：H e pG 2 . 2 . 1 5細 胞； 2：H e pG 2細 胞圖3定 量PC R產(chǎn) 物的 電泳 檢測 Fi g 3 El e c tr o ph o re s is a na ly s is o f th e re a l- t im e RT - P C R pr o du c ts
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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1 韓紅莉;趙中夫;楊柳絮;盧俊敏;常蘊青;吳紅樣;;高遷移率族蛋白B1在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用研究[J];長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2008年05期

2 陳若蟬;黃燕;周蓉蓉;易盼盼;范學(xué)工;;高遷徙率族蛋白B1和糖基化終產(chǎn)物受體與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系[J];中國肝臟病雜志(電子版);2011年04期

3 高珍;張倫理;;Toll樣受體介導(dǎo)的抗乙型肝炎病毒的固有免疫[J];臨床肝膽病雜志;2011年06期

4 王敏;范學(xué)工;黃維亮;徐丹;;HIV感染者/AIDS病人高遷移率族蛋白1的表達及其臨床意義[J];生命科學(xué)研究;2009年06期

5 彭建平;范學(xué)工;劉洪波;;慢性乙型肝炎患者高遷移率族蛋白1mRNA的表達及其臨床意義[J];世界華人消化雜志;2006年02期

本文編號：2698262