【摘要】： 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是引起人類(lèi)丙型肝炎的病原體,其慢性化率高達(dá)85%,與肝硬化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān),嚴(yán)重危害人類(lèi)健康,已成為全球性的、重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。迄今,對(duì)HCV感染發(fā)病的機(jī)制認(rèn)識(shí)不完全清楚,仍然缺乏有效的治療方法,疫苗的研究也遇到很大障礙。在HCV感染過(guò)程中,病毒與細(xì)胞表面相應(yīng)受體的結(jié)合是病毒感染復(fù)制的始動(dòng)環(huán)節(jié),因此探索HCV的受體在HCV感染發(fā)病中的作用一直是研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。CD81、B族I型清道夫受體(scavenger receptor class B type I, SR-BI)與HCV包膜蛋白結(jié)合,參與HCV的入胞過(guò)程,目前已經(jīng)證實(shí),CD81和SR-BI同時(shí)存在是HCV感染肝細(xì)胞的必要條件,但一些非肝源細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD81和SR-BI,仍然不能被HCV感染,說(shuō)明HCV感染肝細(xì)胞可能需要其它特異性因子的共同參與。最新研究發(fā)現(xiàn),肝臟上高度表達(dá)的claudin-1在HCV入胞過(guò)程中發(fā)揮重要的作用,非肝源細(xì)胞在表達(dá)該分子后獲得對(duì)HCV的易感性。Claudin-1是構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接的主要蛋白,有4個(gè)疏水的跨膜區(qū),2個(gè)細(xì)胞外環(huán)結(jié)構(gòu)(extracellular loop, EL),EL1與HCV入胞密切相關(guān),針對(duì)claudin-1 EL1的抗體可以阻斷HCV的感染;此外,claudin-1在介導(dǎo)細(xì)胞間HCV的傳播中起關(guān)鍵作用,細(xì)胞間HCV傳播可逃避宿主免疫系統(tǒng)中和抗體的作用,可能是HCV在宿主體內(nèi)持續(xù)存在的重要原因。因此,深入研究claudin-1在HCV感染中的作用,有助于加深對(duì)HCV感染發(fā)病機(jī)制的理解,為抗病毒治療提供新的思路。 長(zhǎng)期以來(lái),缺乏可靠的供病毒繁殖與傳播的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)一直制約著HCV的研究,2005年Rockefeller大學(xué)HCV研究中心主任Charles M. Rice教授領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室報(bào)道建立HCV感染細(xì)胞模型,解決了這一瓶頸問(wèn)題。Rice教授惠贈(zèng)的HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)(cell-culture derived HCV, HCVcc),為我們的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。為探討claudin-1在HCV感染中的作用,本研究主要完成了以下三方面的工作: 1 HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng) 使用Rice教授惠贈(zèng)的包含HCV全長(zhǎng)序列的2a型J6/JFH嵌合體質(zhì)粒,酶切線(xiàn)性化后作為模版,在T7 RNA聚合酶的作用下,體外轉(zhuǎn)錄獲得全長(zhǎng)HCV轉(zhuǎn)錄本,產(chǎn)物經(jīng)RNA電泳鑒定,并電穿孔轉(zhuǎn)染至Huh-7.5細(xì)胞,包裝出病毒顆粒,重新感染原始的(na?ve)Huh-7.5細(xì)胞,并檢測(cè)病毒感染性。 2 Claudin-1表達(dá)對(duì)HCVcc易感性的影響 從HepG2細(xì)胞中克隆claudin-1基因,插入pEGFP-C3載體中,構(gòu)建真核表達(dá)載體,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,熒光顯微鏡與Western blot觀察claudin-1的表達(dá),檢測(cè)claudin-1對(duì)HCVcc感染的影響;使用化學(xué)合成claudin-1 siRNA序列,抑制Huh-7.5細(xì)胞中claudin-1的表達(dá),檢測(cè)HCVcc感染性的變化。 3γ干擾素對(duì)緊密連接的影響及其對(duì)HCV感染的影響γ干擾素是促炎細(xì)胞因子,可影響細(xì)胞緊密連接;γ干擾素還參與抗HCV免疫應(yīng)答,本研究對(duì)γ干擾素在緊密連接及HCV易感性之間的作用初步探索。Transwell PET膜上培養(yǎng)的腸腺癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞可形成極性結(jié)構(gòu),與體內(nèi)的肝細(xì)胞相似,采用實(shí)時(shí)定量PCR與Western blot檢測(cè)Caco-2細(xì)胞上的claudin-1、CD81及SR-BI的表達(dá)情況。比較Caco-2單層細(xì)胞在γ干擾素處理前后跨上皮電阻、FITC標(biāo)記的葡聚糖滲透性以及Caco-2細(xì)胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)的變化,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察CD81、SR-BI及claudin-1在Caco-2細(xì)胞上的分布情況,檢測(cè)γ干擾素對(duì)HCVcc感染性的影響。 結(jié)果: 1通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄獲得了FL-J6/JFH全長(zhǎng)嵌合體HCV RNA轉(zhuǎn)錄本,經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染Huh-7.5細(xì)胞,在培養(yǎng)上清中檢測(cè)到HCV,用該培養(yǎng)上清可以感染原始的Huh-7.5細(xì)胞。 2從HepG2細(xì)胞中克隆claudin-1基因,成功構(gòu)建了claudin-1的真核表達(dá)載體pEGFP-claudin-1,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48 h后可檢測(cè)到融合蛋白EGFP-claudin-1在293T細(xì)胞中的表達(dá)。293T細(xì)胞上外源性瞬時(shí)表達(dá)claudin-1后,獲得對(duì)HCVcc的易感性。 3化學(xué)合成的siRNA序列可以有效抑制Huh-7.5細(xì)胞上的claudin-1的表達(dá),并阻斷HCVcc對(duì)Huh-7.5細(xì)胞的感染。 4 Caco-2細(xì)胞表達(dá)HCV的關(guān)鍵受體:CD81、SR-BI及claudin-1,支持HCVcc的感染。 5γ干擾素可以下調(diào)claudin-1的表達(dá),造成Caco-2細(xì)胞間緊密連接被破壞,通透性增加。γ干擾素同時(shí)影響claudin-1、CD81及SR-BI在細(xì)胞上的分布。γ干擾素處理后Caco-2細(xì)胞對(duì)HCVcc的易感性下降。 結(jié)論: 1緊密連結(jié)蛋白claudin-1是HCV的重要受體,影響細(xì)胞對(duì)HCV的易感性,可能與HCV的嗜肝性有關(guān)。 2γ干擾素可以降低claudin-1的表達(dá),破壞緊密連接,使CD81及SR-BI的分布發(fā)生變化,可能影響細(xì)胞對(duì)HCV的易感性。
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13圖 1 HCV 入胞示意圖[13]1.1 CD81CD81 分子是一種非糖基化膜蛋白，有 236 個(gè)氨基酸殘基，分子量為25.8 kD。因它對(duì)于人 T 淋巴細(xì)胞系的增殖反應(yīng)具有顯著的抑制作用而被命名為抗增生抗體識(shí)別的靶抗原（target of antiproliferative antibody-1,TAPA-1），后統(tǒng)一命名為 CD81。它屬于四次跨膜蛋白（teraspanin）超家族（TM4SF）成員，含有 4 個(gè)跨膜區(qū)和 2 個(gè)胞外區(qū)，N、C 端均在胞內(nèi)。四次跨膜蛋白的基本特征是它們通過(guò)同源或是異源蛋白交聯(lián)形成多聚體，在細(xì)

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文NS4B 蛋白是膜蛋白；NS5A 蛋白在細(xì)胞中以磷酸化形式存在，可以結(jié)合NS5B 蛋白并調(diào)節(jié)其功能，其序列中具有干擾素敏感決定區(qū)。NS5B 蛋白具有 RNA 依賴(lài)的 RNA 聚合酶活性（RNA-dependent RNApolymerase, RdRp），負(fù)責(zé) HCV 基因組 RNA 的復(fù)制[42,43]。3’-NCR 由高變區(qū)、多聚嘧啶區(qū)(polyU/UC)組成，對(duì) RNA 復(fù)制起關(guān)鍵作用。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R512.63

【參考文獻(xiàn)】

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1 成軍;任進(jìn)余;李莉;陸志檬;李克;洪源;陸蔭英;王剛;劉妍;張玲霞;陳菊梅;;丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)基因小鼠引起肝臟脂肪變[J];世界華人消化雜志;2002年09期

2 任進(jìn)余,成國(guó)祥,孔曉飛,陳建泉,周汝江,陸志檬;丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立[J];中華肝臟病雜志;2005年07期

3 劉秋平,賈戰(zhàn)生,杜德偉,李光玉,潘蕾,魏欣,羅新棟,王全楚;人CD81真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)[J];世界華人消化雜志;2004年03期

4 賈戰(zhàn)生;杜德偉;劉秋平;王春雨;秦鴻雁;魏欣;趙甫濤;李光玉;韓驊;;CD81介導(dǎo)丙型肝炎病毒入胞作用的研究[J];中華肝臟病雜志;2006年07期

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本文編號(hào)：2694094