發(fā)布時間：2020-06-03 00:28

【摘要】：頑固性功能性便秘是一種常見的結(jié)腸功能障礙性疾病,因其程度重,藥物治療效果不佳,嚴重影響患者的生活質(zhì)量,最終多需要外科治療。根據(jù)結(jié)腸的直徑,便秘可分為兩種類型:結(jié)腸直徑正常型和巨結(jié)腸型。特發(fā)性巨結(jié)腸是巨結(jié)腸型便秘的一種,表現(xiàn)為頑固性便秘。頑固性便秘和特發(fā)性巨結(jié)腸的發(fā)病機制尚不清楚。腸道菌群是人體主要微生物群落,腸腔內(nèi)細菌種類多,數(shù)量大,是腸屏障的重要組成部分。腸道菌群參與機體的營養(yǎng)代謝,免疫調(diào)節(jié),上皮基因的表達的調(diào)控,屏蔽致病菌等多種生理過程。近年來,一些非培養(yǎng)的分子生物學方法,如變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE),克隆文庫,DNA微矩等,被用于研究疾病狀態(tài)下的腸道菌群變化,如抗生素相關性腸炎、炎癥性腸病、腸易激綜合征等。基于腸道菌群在便秘和特發(fā)性巨結(jié)腸的發(fā)生和發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用,有必要使用分子生物學和生態(tài)學方法來加深對便秘和特發(fā)性巨結(jié)腸患者結(jié)腸菌群改變的認識。便秘(包括特發(fā)性巨結(jié)腸)狀態(tài)下,結(jié)腸內(nèi)容物停留時間延長,結(jié)腸菌群改變,這些都對結(jié)腸屏障功能提出了更為嚴峻的考驗。結(jié)腸粘膜緊密連接和結(jié)腸粘液屏障對于維持結(jié)腸屏障功能極為重要。對于便秘和特發(fā)性巨結(jié)腸患者結(jié)腸粘膜緊密連接和粘液屏障的研究可以加深我們對于便秘和特發(fā)性巨結(jié)腸的認識。本研究中,我們使用DGGE檢測頑固性功能性便秘和特發(fā)性巨結(jié)腸患者結(jié)腸粘膜菌群改變特征,找出顯著改變的細菌。同時,我們觀察結(jié)腸粘膜上皮緊密連接和杯狀細胞改變特征,對于頑固性功能性便秘和特發(fā)性巨結(jié)腸的基本病理生理有更深刻的認識,為今后臨床實踐提供一定的理論依據(jù)。第一部分頑固性功能性便秘和特發(fā)性巨結(jié)腸患者結(jié)腸粘膜菌群改變特征研究一頑固性功能性便秘患者結(jié)腸粘膜菌群改變特征目的:研究頑固性功能性便秘患者結(jié)腸粘膜菌群的改變特征,并找出有特征性變化的菌株。病人和方法:實驗分為兩組:頑固性功能性便秘組(便秘組)16人;對照組9人。在術(shù)中獲取病人乙狀結(jié)腸粘膜標本,提取DNA,擴增后進行變性梯度凝膠電泳(DGGE),觀察菌群結(jié)構(gòu)變化,使用Quantity One軟件分析DGGE條帶,對菌群的結(jié)構(gòu)進行相似性,多樣性和主成分分析(PCA)分析,對有顯著變化的條帶割膠測序,并使用NCBI的BLAST工具與Nucleotide collection(nr/nt)數(shù)據(jù)庫內(nèi)基因比對,鑒定其細菌種屬。結(jié)果:便秘患者結(jié)腸粘膜菌群與對照組有明顯差異。便秘組結(jié)腸粘膜菌群優(yōu)勢菌群條帶數(shù)明顯低于對照組(18.38±5.20vs28.22±5.24P0.01),便秘組患者結(jié)腸粘膜菌群香農(nóng)多樣性指數(shù)明顯少于對照組(P=0.01),提示頑固性功能性便秘患者結(jié)腸粘膜菌群多樣性減少。頑固性功能性便秘腸粘膜菌群的特征性改變表現(xiàn)為:3種擬桿菌菌門細菌和2種硬壁菌菌門細菌相對豐度減少,同時伴有2種未曾培養(yǎng)過的細菌相對豐度的明顯增加(P0.05)。結(jié)論:頑固性功能性便秘患者結(jié)腸粘膜存在菌群紊亂,表現(xiàn)為:菌群多樣性減少,擬桿菌菌門和硬壁菌菌門細菌相對豐度減少,同時伴有兩種未曾培養(yǎng)過的細菌相對豐度的明顯增加。研究二特發(fā)性巨結(jié)腸患者結(jié)腸粘膜菌群改變特征目的:研究特發(fā)性巨結(jié)腸患者結(jié)腸粘膜菌群的改變特征,并找出有特征性變化的菌株。病人和方法:實驗分為兩組:特發(fā)性巨結(jié)腸組(巨結(jié)腸組)10人;對照組11人。在術(shù)中獲取病人乙狀結(jié)腸粘膜標本,提取DNA,擴增后進行變性梯度凝膠電泳,觀察菌群的結(jié)構(gòu)變化,對菌群結(jié)構(gòu)進行相似性,多樣性和主成分分析分析,對有顯著變化的條帶割膠測序,鑒定其細菌種屬。結(jié)果:巨結(jié)腸組患者結(jié)腸粘膜菌群與對照組有明顯差異。巨結(jié)腸組患者結(jié)腸粘膜菌群條帶數(shù)明顯多于對照組(P0.01),巨結(jié)腸組患者結(jié)腸粘膜菌群香農(nóng)多樣性指數(shù)明顯增多(P0.01),提示巨結(jié)腸組結(jié)腸粘膜菌群多樣性增多。巨結(jié)腸組粘膜菌群的特征性變化菌群是:5種擬桿菌菌門細菌相對豐度明顯升高伴有1種擬桿菌菌門細菌相對豐度明顯降低。結(jié)論:特發(fā)性巨結(jié)腸患者結(jié)腸粘膜存在菌群紊亂,其特征性表現(xiàn)為:菌群多樣性增多,5種擬桿菌菌門細菌的相對豐度增加伴1種擬桿菌菌門細菌相對豐度明顯降低。第二部分頑固性功能性便秘和特發(fā)性巨結(jié)腸患者結(jié)腸粘膜緊密連接和杯狀細胞的研究研究一頑固性功能性便秘和特發(fā)性巨結(jié)腸患者結(jié)腸粘膜緊密連接的研究目的:研究頑固性功能性便秘和特發(fā)性巨結(jié)腸患者結(jié)腸粘膜緊密連接的微觀結(jié)構(gòu)和緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1的變化特征。病人和方法:病人分為三組,頑固性功能性便秘組(便秘組)、特發(fā)性巨結(jié)腸組(巨結(jié)腸組)和對照組各8人。在術(shù)中獲取病人乙狀結(jié)腸標本,進行:普通病理染色觀察結(jié)腸上皮微絨毛的變化;電鏡觀察緊密連接的超微結(jié)構(gòu)的變化;蛋白印跡對腸粘膜緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1進行半定量分析;免疫熒光檢測對Occludin和Claudin-1進行原位分析。結(jié)果:便秘組和巨結(jié)腸組病人結(jié)腸粘膜上皮微絨毛光鏡下無明顯損傷。便秘組、巨結(jié)腸組和對照組結(jié)腸粘膜緊密連接結(jié)構(gòu)均完整,緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1表達量無明顯差異、免疫熒光表達在位。結(jié)論:頑固性功能性便秘和特發(fā)性巨結(jié)腸患者結(jié)腸粘膜緊密連接結(jié)構(gòu)完整,緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1表達與對照組無差異。研究二頑固性功能性便秘和特發(fā)性巨結(jié)腸患者結(jié)腸粘膜杯狀細胞的研究目的:研究頑固性功能性便秘和特發(fā)性巨結(jié)腸患者結(jié)腸粘膜杯狀細胞的變化。病人和方法:病人分為三組:頑固性功能性便秘組(便秘組)、特發(fā)性巨結(jié)腸組(巨結(jié)腸組)和對照組各8人。在術(shù)中獲取病人乙狀結(jié)腸標本,進行:HE染色了解結(jié)腸微絨毛形態(tài),對杯狀細胞進行計數(shù);西弗氏/阿利辛蘭(AB/PAS)染色,對杯狀細胞粘液進行特殊染色,進一步對杯狀細胞進行分析。結(jié)果:HE染色和AB/PAS染色均可以看到:便秘組和巨結(jié)腸組患者乙狀結(jié)腸微絨毛較對照組變細,單位面積內(nèi)杯狀細胞增多(p0.01),巨結(jié)腸組患者乙狀結(jié)腸絨毛較便秘組更細,杯狀細胞數(shù)更多(p0.01)。結(jié)論:在頑固性功能性便秘和特發(fā)性巨結(jié)腸狀態(tài)下,結(jié)腸微絨毛變細,單位面積內(nèi)杯狀細胞相對增多,特發(fā)性巨結(jié)腸較頑固性功能性便秘變化更明顯。
【圖文】：

ＤＧＧＥ指紋圖譜逡逑ＤＧＧＥ圖中，每個縱向泳道代表一個樣品的菌群結(jié)構(gòu)，每個泳道里的一代表一種細菌，條帶的強度代表該細菌的數(shù)量。在水平方向位于同一位置認為是同一種細菌。如圖２所示，Ａ１到Ａ９為對照組，，Ｂ１到Ｂ１６為便秘代表一個病人的結(jié)腸粘膜菌群結(jié)構(gòu)，Ｃ５、Ｃ６分別代表一種細菌，Ｃ１４的顯高于Ｃ９，那么說明Ｃ１４對應的細菌量明顯多于Ｃ９，邋Ｃ１４和Ｒ１２在同一，認為Ｃ１４和Ｒ１２是同一種細菌。逡逑．３．２相似性分析逡逑

圖２頑固性功能性便秘和對照組患者結(jié)腸粘膜標本的ＤＧＧＥ條帶。Ａ代表對照逡逑組患者（Ａ１－Ａ９）邋，邋Ｂ代表頑固性功能性便秘患者（Ｂ１－Ｂ１６）。逡逑相似性分析顯示：所有的條帶主要分為兩大組，第一組中有８條條帶，其中逡逑有６條是對照組的條帶；第二組中有１６條條帶，其中１３條條帶是頑固性功能性便逡逑秘組的條帶。由此可以看出，頑固性功能性便秘組患者結(jié)腸粘膜菌群和對照組病逡逑人粘膜菌群有明顯差異。頑固性功能性便秘患者和對照組病人結(jié)腸粘膜菌群的逡逑ＤＧＧＥ指紋圖譜顯示：與對照組病人結(jié)腸粘膜菌群結(jié)構(gòu)相比，頑固性功能性便秘逡逑患者菌群多樣性降低，一些條帶相對豐度明顯增高。逡逑
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R574.62

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本文編號：2694002