【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)感染后通常在體內(nèi)保持低水平復(fù)制,但卻極易引起慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌,具體機(jī)制至今尚不是很清楚。已知細(xì)胞周期的紊亂是腫瘤細(xì)胞發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié),一些與腫瘤發(fā)生相關(guān)的病毒感染均可引起細(xì)胞周期的紊亂。HCV是單正鏈RNA病毒,其基因組可編碼包括結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白在內(nèi)的至少10種病毒蛋白。其中NS5B是HCV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白之一,具有RNA依賴的RNA多聚酶活性,是HCV復(fù)制的關(guān)鍵酶。近來有報道稱NS5B除直接參與HCV復(fù)制外,還可以通過與宿主因子的相互作用影響正常細(xì)胞功能,例如免疫反應(yīng)及細(xì)胞周期等,從而引起病變發(fā)生。已有報道提示NS5B蛋白可影響細(xì)胞周期進(jìn)展,但不同研究小組所觀察到的現(xiàn)象不太一致,且詳細(xì)機(jī)制還不是很清楚。 為確認(rèn)NS5B對細(xì)胞周期的影響,首先在肝癌細(xì)胞系HepG2中構(gòu)建了可由四環(huán)素調(diào)控的NS5B穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株(HepG2 Tet-on NS5B)。經(jīng)G418和hygromycin B共同篩選,最終得到低背景高誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞克隆。Dox (doxycycline)誘導(dǎo)后,NS5B可被標(biāo)簽抗體和內(nèi)源性抗體同時檢測到,提示細(xì)胞系構(gòu)建成功。然后利用流式細(xì)胞術(shù)在該細(xì)胞系中檢測NS5B對細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示,NS5B誘導(dǎo)表達(dá)后,S期細(xì)胞明顯增多,提示NS5B可使細(xì)胞周期S期延長。 為探討NS5B影響細(xì)胞周期的分子機(jī)制,包括何種宿主蛋白參與該過程,應(yīng)用酵母雙雜交試驗從肝細(xì)胞文庫中篩選了可能與NS5B存在相互作用的細(xì)胞蛋白,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞蛋白CINP (cyclin-dependent kinase 2 (CDK2)-interacting protein)為候選蛋白之一。鑒于CINP跟細(xì)胞周期相關(guān),可以推測NS5B可能通過與CINP的相互作用影響了細(xì)胞周期。為了驗證這一假設(shè),利用GST pull-down和免疫共沉淀證實NS5B與CINP之間的相互作用,免疫熒光激光共聚焦試驗也觀察到兩者在胞漿核周區(qū)域存在部分共定位。截短體試驗進(jìn)一步表明兩者之間的相互作用,且發(fā)現(xiàn)CINP的C末端負(fù)責(zé)與NS5B相互作用,而NS5B的84-95及455464兩段氨基酸負(fù)責(zé)與CINP相互作用。 CINP最早是在HeLa細(xì)胞中以CDK2相互作用蛋白被發(fā)現(xiàn),前期研究表明CINP可與染色體結(jié)合,參與DNA的合成。為了確認(rèn)CINP是否具有對細(xì)胞周期的調(diào)控功能,用胸腺嘧啶核苷使HeLa細(xì)胞同步化于細(xì)胞周期的G1/S期,再轉(zhuǎn)染CINP及相應(yīng)空載體,流式檢測細(xì)胞周期變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)空載體轉(zhuǎn)染組可進(jìn)入正常細(xì)胞周期,而CINP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞仍停滯在G1期。用小干擾RNA將內(nèi)源性CINP干擾后,S期細(xì)胞顯著增多。這些結(jié)果提示CINP確實存在對細(xì)胞周期的調(diào)控功能。接著將不能與CINP相互作用的NS5B截短突變體(ANS5B)與全長NS5B或相應(yīng)空載體分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)和CCK-8檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與全長NS5B相比,ΔNS5B和空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期和細(xì)胞生長均不受影響,提示NS5B對細(xì)胞周期的影響依賴其與CINP的結(jié)合。 為了進(jìn)一步探討NS5B與CINP相互作用之后影響細(xì)胞周期的分子機(jī)制,首先檢測NS5B對CINP的蛋白表達(dá)是否有影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同情況下NS5B的表達(dá)對CINP的蛋白水平都沒有明顯改變。由于CINP是胞核蛋白,而NS5B主要定位于胞漿,先前的共聚焦結(jié)果顯示兩者可在核周區(qū)域部分共定位,提示NS5B可能使CINP發(fā)生了亞細(xì)胞定位的改變。激光共聚焦試驗驗證了這個假設(shè)：全長NS5B可使原本在核內(nèi)的CINP重新定位于胞漿,而不與CINP結(jié)合的截短體△NS5B則不具備這個功能。同時,在HCV亞基因組復(fù)制子和細(xì)胞培養(yǎng)病毒JFH-1感染的Huh7.5細(xì)胞中也可觀察到CINP定位的改變。除此之外,核漿分離的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)CINP在NS5B表達(dá)的細(xì)胞中發(fā)生從核到漿的移位；將JFH-1感染后的Huh7.5細(xì)胞持續(xù)傳代來模擬慢性感染過程,也得到類似的結(jié)果。 DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response, DDR)是DNA損傷發(fā)生時調(diào)控細(xì)胞周期的重要信號通路。DNA損傷發(fā)生后,有三個細(xì)胞周期檢查點可被激活：G1/S期阻止細(xì)胞進(jìn)入S期；intra-S期抑制DNA合成；G2/M期防止損傷的DNA繼續(xù)分裂。近期有報道顯示CINP也可參與DNA損傷反應(yīng)通路并具有維持基因組穩(wěn)定性的作用,提示DDR可能介導(dǎo)了NS5B/CINP相互作用后細(xì)胞周期的紊亂。因為NS5B使CINP從核到漿的移位減少了核內(nèi)發(fā)揮功能的CINP的量,用RNA干擾直接下調(diào)CINP后發(fā)現(xiàn)DDR通路中的可對S期進(jìn)行調(diào)控的重要分子pRb、pChk1顯著降低而p21則明顯升高。與此相一致,NS5B誘導(dǎo)表達(dá)后pRb、pChk1也有明顯下調(diào)且可被CINP的過表達(dá)所部分回復(fù)。這些結(jié)果提示NS5B可能通過與CINP相互作用影響了DDR通路進(jìn)而對細(xì)胞周期產(chǎn)生影響。 上述結(jié)果表明,HCV NS5B與CINP的相互作用可使CINP發(fā)生從胞核到胞漿的移位,從而影響了DDR通路,使細(xì)胞S期延長。這為深入了解HCV持續(xù)性感染和腫瘤發(fā)生的機(jī)制開辟了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R512.63

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2693043