【摘要】： microRNAs(miRNAs)是一類大小為18-23 nt的小的非編碼RNA分子,它們是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的、70-90個堿基大小的單鏈miRNA前體(pre-miRNA)經(jīng)Dicer加工產(chǎn)生。miRNA在生物界中是廣泛存在的,自從第一個miRNA分子在線蟲中發(fā)現(xiàn),迄今為止,已發(fā)現(xiàn)在人、動物、植物等多種生物中存在。目前,已有超過3,500個miRNA被鑒定,在人體中miRNA的種類也超過了450種。 研究發(fā)現(xiàn),miRNA序列不是任意的,在很大的進(jìn)化距離中具有保守性,提示這種分子在生命活動中可能扮演重要的角色。miRNA在胞漿中與Argonaute等蛋白分子形成miRISC(miRNA induce silencing complex);在miRNA的指引下,miRISC可以特異性的識別mRNA分子的3'端約30堿基長度的非編碼區(qū),并以一種不完全匹配的方式結(jié)合,抑制mRNA翻譯蛋白分子。正是由于這種不完全匹配的結(jié)合方式,使得一種miRNA可以同多種mRNA分子結(jié)合。人們通過生物信息學(xué)手段發(fā)現(xiàn),人類有1/3以上的的蛋白編碼基因中都受miRNA調(diào)節(jié)。miRNA通過調(diào)節(jié)目的蛋白的表達(dá),在生物體發(fā)育、信號傳導(dǎo)、凋亡、細(xì)胞增殖等生理和病理過程中都發(fā)揮重要作用。 既然miRNA在生命活動中扮演如此重要的角色,它們是否也在病毒感染性疾病中的發(fā)生、發(fā)展過程中也有重要作用?miRNA本身的幾個特性提示其可能在病毒感染過程中發(fā)揮作用。一方面,miRNA分子較小,沒有免疫原性,可以逃避機(jī)體的免疫系統(tǒng);miRNA較小,只有22 nt左右大小,對于充分利用基因組每個堿基的病毒來說通過編碼小分子量的miRNA來調(diào)控基因是一種十分“經(jīng)濟(jì)”的選擇;另外,一種miRNA可與多個mRNA結(jié)合,調(diào)節(jié)多種蛋白的表達(dá),是一種十分有效的調(diào)控基因表達(dá)的手段。因此,病毒完全有可能借助于miRNA調(diào)控眾多蛋白表達(dá),使宿主細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境有利于病毒的生命活動。后續(xù)的大量研究結(jié)果也證實了上述猜想,很多病毒可以通過某些機(jī)制,改變宿主細(xì)胞內(nèi)各種miRNA表達(dá),使宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境有利病毒的生存。這種現(xiàn)象也提示我們可以通過研究宿主細(xì)胞感染病毒前后各種miRNA表達(dá)變化,并在此基礎(chǔ)之上,研究表達(dá)發(fā)生改變的miRNA的作用的靶標(biāo)分子,探索這些miRNA在病毒生命周期中的作用,將有利于我們深入了解病毒感染性疾病的發(fā)病機(jī)制,并能為這類疾病的診斷、預(yù)防及治療等提供有益的幫助。 乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV),是一種小的雙鏈DNA病毒,是目前已知的感染人類最小的雙鏈DNA病毒,屬于屬于嗜肝DNA病毒科(hepadnavividae)。HBV感染肝細(xì)胞后,能引起一系列的疾病,如急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等,還往往伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥。據(jù)推測,世界范圍內(nèi)有3.5億人為乙肝慢性感染,是威脅人類健康的主要的感染性疾病之一。盡管迄今為止,關(guān)于HBV感染的研究取得一定的進(jìn)展,對于這種疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及防治有了一定程度上的認(rèn)識。但在這些領(lǐng)域還有很多未知的空白有待填補(bǔ)。尋找HBV感染后肝臟細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平發(fā)生改變的miRNA,然后在此基礎(chǔ)之上研究這些特定miRNA功能,看其是否在HBV感染過程中發(fā)揮作用,或許有利于進(jìn)一步揭示HBV感染、特別是慢性HBV感染的致病機(jī)制。正是基于此,在本研究中,我們利用miRNA芯片技術(shù),分析HBV感染前后miRNA變化情況,尋找顯著上調(diào)或下調(diào)的miRNA;然后分析這些miRNA的功能,看其是否在HBV感染中發(fā)揮作用;以期為HBV感染機(jī)制的闡明,以及乙型肝炎的預(yù)防和治療提供幫助。 首先,我們利用Exiqon公司的miRNA microarray芯片(8.0),以HepG2.2.15為實驗組,以HepG2細(xì)胞為對照,分析二者miRNA表達(dá)譜系的差異,找出表達(dá)水平顯著改變(上調(diào)或下調(diào)超過2倍)的miRNA。HepG2.2.15細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染HBV基因后的細(xì)胞,HBV基因已穩(wěn)定整合,能分泌各種病毒蛋白和病毒顆粒,是研究HBV感染的一個理想的體外模型。Exiqon公司的miRNA microarray芯片能檢測到miRBase數(shù)據(jù)庫(8.0版)中所有已注冊的人的miRNA分子;而且該芯片基于鎖核酸(Locked Nucleic Acids,LNA)技術(shù)構(gòu)建,使芯片雜交時具有較高而一致的雜交溫度,可以較靈敏、特異性地檢測差異表達(dá)的miRNA。利用該芯片對HepG2.2.15和HepG2細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析后,發(fā)現(xiàn)有9個miRNA的表達(dá)發(fā)生顯著變化。其中上調(diào)的有3個,分別為hsa-miR-194、hsa-miR-200a和hsa-miR-345;下調(diào)的miRNA共有6個,分別為:hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-24、hsa-let-7a、hsa-let-7c、hsa-let-7f和hsa-miR-23b。 為了進(jìn)一步驗證上述芯片結(jié)果的可靠性,我們采用Taqman miR-qRT-PCR試劑盒(Applied Biosystems,Foster City,America)對HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中上述9種miRNA分子表達(dá)情況進(jìn)行分析。U6是一種在各種細(xì)胞中表達(dá)較為穩(wěn)定的RNA,在本實驗中作為內(nèi)對照使用。所得數(shù)據(jù)采用2~(-△△CT)方法進(jìn)行分析。最終分析結(jié)果與芯片結(jié)果相符,即顯著下調(diào)的為hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-24、hsa-let-7a、hsa-let-7c、hsa-let-7f和hsa-miR-23b;而顯著上調(diào)的miRNA為hsa-miR-194、hsa-miR-200a和hsa-miR-345,說明芯片結(jié)果是可靠的。 然后,我們進(jìn)一步驗證上述miRNA表達(dá)發(fā)生改變,是HBV引起的一種特異性變化,還是一般病毒感染后引起的一種非特異性變化。我們首先建立了4種非HBV感染的HepG2細(xì)胞,并進(jìn)行了鑒定。這4種病毒分別為貓免疫缺陷病毒(felineimmunodeficiency virus,FIV)、鼠干細(xì)胞病毒(Murine Stem Cell Virus,MSCV)、登革病毒(Dengue virus,DV)、單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV),其中前3種為RNA病毒,后一種為DNA病毒。然后,利用Taqman RT-PCR試劑盒檢測這些病毒感染細(xì)胞株(即HepG2-FIV、HepG2-MSCV、HepG2-DV、HepG2-HSV)中hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-24、hsa-let-7a、hsa-let-7c、hsa-let-7f、hsa-miR-23b、hsa-miR-194、hsa-miR-200a和hsa-miR-345的表達(dá)情況。結(jié)果表明在這些非HBV感染的HepG2細(xì)胞中,上述miRNA的表達(dá)未發(fā)生顯著性改變,提示,HepG2.2.15細(xì)胞中上述miRNA表達(dá)發(fā)生顯著改變是HBV特異性的。 由于HepG2.2.15是通過將含有HBV全基因組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞建立的穩(wěn)定克隆,是模擬HBV感染,與真正的HBV感染細(xì)胞有一定的差異。而PLC/PRF/5是從—HBV感染者體內(nèi)分離得到,是自然整合有HBV的一株肝癌細(xì)胞株,是研究HBV感染的另外常用的體外模型。因此,我們進(jìn)一步檢測了上述miRNA在該細(xì)胞中的表達(dá)情況。實驗結(jié)果表明:hsa-miR-194和hsa-miR-200a顯著性上調(diào);hsa-let-7a、hsa-let-7c和hsa-let-7f下調(diào)表達(dá),而hsa-miR-24、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-23b和hsa-miR-345的表達(dá)水平則沒有發(fā)生顯著性變化。提示hsa-miR-194、hsa-miR-200a、hsa-let-7a、hsa-let-7c和hsa-let-7f表達(dá)發(fā)生改變可能與HBV感染相關(guān)。 但無論分析miRNA在HepG2.2.15細(xì)胞的表達(dá)情況、在非HBV感染細(xì)胞株中的表達(dá)情況,還是在PLC/PRF/5細(xì)胞的表達(dá)情況,只是為我們提供了一種離體狀態(tài)下的情況。真正的體內(nèi)過程往往與體外過程有不小的差異,因此我們進(jìn)一步檢測了miRNA在慢性乙肝患者肝臟標(biāo)本中的表達(dá)情況,揭示miRNA在體內(nèi)的表達(dá)狀態(tài)。利用定量PCR方法檢測了12個慢性乙肝患者的穿刺標(biāo)本miRNA表達(dá)情況,以3例肝移植手術(shù)中健康供體肝臟組織作為正常對照。結(jié)果表明:hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-345、hsa-miR-23b、hsa-miR-194表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生顯著性改變;hsa-miR-24、hsa-let-7c和hsa-mir-200a在某些標(biāo)本中表達(dá)下調(diào),而在另外一些標(biāo)本中則表達(dá)上調(diào);只有hsa-let-7a和hsa-let-7f在12例標(biāo)本中均顯著性下調(diào)。綜上所述,hsa-let-7a和hsa-let-7f最可能是HBV感染后肝臟細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平發(fā)生顯著改變的miRNA。那么,是否HBV通過下調(diào)hsa-let-7a和hsa-let-7f,改變肝臟細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,使之更有利于HBV的感染過程? 既往研究表明,miRNA可能通過以下幾種機(jī)制參與病毒感染的致病過程:宿主的miRNA作用于病毒基因,調(diào)控病毒基因的表達(dá);病毒基因組編碼病毒來源的miRNA,調(diào)控病毒基因的表達(dá);病毒基因組來源的miRNA作用宿主基因,調(diào)控宿主基因的表達(dá)。因此,HBV感染后肝細(xì)胞內(nèi)變化的miRNA,即hsa-let-7a和hsa-let-7f是否也可以作用于HBV基因,并調(diào)控這些基因編碼蛋白的表達(dá)? ViTa是由Hsu PW等建立的一個軟件(http://vita.mbc.nctu.edu.tw/),可以較好地預(yù)測人的miRNA在病毒基因中靶標(biāo)。我們借助于該軟件預(yù)測了hsa-let-7a和hsa-let-7f在HBV基因組中的靶標(biāo)。預(yù)測結(jié)果表明:hsa-let-7a在HBV基因組中有一個潛在的靶標(biāo),3105-3135處位于Pres1和多聚酶(P蛋白)的共同編碼區(qū)(3105-3135處),該區(qū)域在乙肝的生命周期中具有重要作用;沒有發(fā)現(xiàn)HBV基因組中有hsa-let-7f的作用位點(diǎn)。 為了驗證該潛在位點(diǎn)是否為hsa-let-7a的作用位點(diǎn),我們將該序列導(dǎo)入pMIR-REPORT熒光素酶表達(dá)載體,構(gòu)建報告系統(tǒng);同時,將let-7a表達(dá)質(zhì)粒PH1-RNA-let-7a導(dǎo)入293T細(xì)胞,通過抗生素篩選后得到單克隆,qRT-PCR鑒定后,我們得到2株穩(wěn)定表達(dá)let-7a的細(xì)胞株,293-7a-1和293-7a-2。將含有靶序列的pMIR-report導(dǎo)入293-7a-1和293-7a-2后,進(jìn)行熒光素酶實驗,結(jié)果提示,hsa-let-7a可以作用該位點(diǎn),降低熒光素酶的表達(dá)。為進(jìn)一步驗證,我們將let-7a表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入HepG2.2.15細(xì)胞株,上調(diào)hsa-let-7a的表達(dá),檢測HBV拷貝數(shù)及上清中Pres1蛋白水平變化情況。實驗結(jié)果表明,hsa-let-7a上調(diào)后,HBV DNA拷貝數(shù)顯著降低,上清中pres1蛋白水平也明顯下降,進(jìn)一步證實了HBV基因組中hsa-let-7a作用位點(diǎn)的存在。 綜上所述,在本實驗中,我們借助于microRNA芯片技術(shù),以HepG2.2.15細(xì)胞作為HBV的體外感染模型以HepG2細(xì)胞作為對照,分析表達(dá)顯著改變的miRNA;然后利用定量PCR對芯片結(jié)果進(jìn)行驗證后,進(jìn)一步檢測了這些miRNA在一系列的細(xì)胞株及慢性乙肝患者肝穿標(biāo)本中的表達(dá)情況,結(jié)果提示HBV感染引起肝細(xì)胞內(nèi)hsa-let-7a和hsa-let-7f顯著下調(diào)。然后,我們進(jìn)一步分析了hsa-let-7a和hsa-let-7f的靶標(biāo),利用ViTa軟件預(yù)測二者在HBV基因組的潛在作用位點(diǎn),并通過熒光素酶等實驗進(jìn)行了驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa-let-7a能作用于HBV的多聚酶和PreS1蛋白的共同編碼區(qū)�；蛟S,HBV感染肝細(xì)胞后,通過某種機(jī)制下調(diào)hsa-let-7a的表達(dá),使HBV的PreS1蛋白和多聚酶免受let-7a的抑制,從而使肝細(xì)胞內(nèi)環(huán)境有利于HBV的生命活動,可能是HBV感染的致病機(jī)制之一。
【圖文】：

值三2.1判斷為陽性，否則為陰性。陰性對照OD值低于0.05時作0.05計算，高于0.05時按實際OD值計算。令士甲二曰刁又一、間接免疫熒光法檢測HePGZ和HePG2.2.15細(xì)胞白蛋白表達(dá)結(jié)果白蛋白是體內(nèi)特異地由肝細(xì)胞合成和分泌的蛋白[30]，，其在細(xì)胞中表達(dá)標(biāo)志著肝細(xì)胞原型和功能。本實驗中，我們使用兔抗人Albumin抗體(Merck)，間接免疫熒光法檢測HePGZ和HePG2.2.巧細(xì)胞中人白蛋白表達(dá)情況，以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株Ecv304細(xì)胞作為陰性對照。間接免疫熒光組化染色顯示:在HePGZ和HePG2.2.15細(xì)胞胞漿中都有綠色熒光存在，而ECv304細(xì)胞的胞漿中則沒有，提示HePGZ和HePG2.2.15細(xì)胞能合成白蛋白，是肝臟來源的細(xì)胞。

hsa一miR一3450.0514859230刃25547hsa-miR一200a3541330.0921532850.03307表5.下調(diào)表達(dá)的m1RNATab5.Down一regulatedmiRNAHePG22.15HePGZ實驗組標(biāo)準(zhǔn)值對照組(對照組)RowNamC(實驗組)hsa一miR一30a一SPhsa-mi凡24hsa一let一7f0.0634124090.128603894681960.82302308394160.5160.2320776850.7880、1833289890‘5481163040742021651083:5力3231494243886n目IJn，n只叮產(chǎn)hsa·!et一7ahsa一let一7e5hsa一miR一23b14620.3810610010.774CCC川沁rb.sedonsortedrawd成aaa
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R512.6

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7 吉娜;自發(fā)性高血壓大鼠肥厚心肌和纖維化腎臟組織中microRNA-21的表達(dá)[D];中國醫(yī)科大學(xué);2010年

8 陳娟;靶向Livin的microRNA干擾對人卵巢癌細(xì)胞SKOV3體外作用的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2010年

9 梅林;卡氏肺孢子菌MSG-UCS基因microRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

10 孔飛飛;靶向YB-1基因的MicroRNA對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

本文編號：2692025