發(fā)布時間：2020-06-01 13:05

【摘要】： 目的:暴發(fā)性肝衰竭(fulminant hepatic failure,FHF)是一種由多種原因引起的肝細胞急性大量壞死和嚴重肝功能損傷所致的臨床綜合征。暴發(fā)性肝衰竭具有起病急,病情進展快,并發(fā)癥多,治療難度大,死亡率高,預(yù)后極差的特點,是當前肝病研究的熱點和難點。其發(fā)病機制非常復(fù)雜,迄今未能完全闡明。 在我國,引起FHF的病因主要是病毒性肝炎,其次是藥物和中毒等因素。目前的研究認為,細胞因子網(wǎng)絡(luò)的激活在暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病機制中起著重要作用。其中核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)在暴發(fā)性肝衰竭炎癥反應(yīng)中的重要調(diào)控作用已被證實,NF-κB是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,被認為是調(diào)節(jié)前炎癥因子基因表達的關(guān)鍵成分之一,誘導(dǎo)炎癥細胞因子、趨化因子、黏附分子、炎性酶等的表達,在多種炎癥性疾病的炎癥部位高度活化。已有研究證實,在肝臟炎癥、纖維化、肝細胞凋亡與再生、肝臟缺血再灌注損傷等病理生理過程中均伴有NF-κB的活化,是調(diào)控肝臟病理損害重要的轉(zhuǎn)錄因子。 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì),在很多炎癥反應(yīng)中均有它們的活化和表達。TNF-α本身是NF-κB的激活劑,而NF-κB的活化又能促進TNF-α的活化和釋放,形成一個惡性循環(huán)。TNF-α和NF-κB的活化皆能誘導(dǎo)iNOS,從而引起一氧化氮(nitric oxide, NO)釋放,形成級聯(lián)瀑布效應(yīng),促進肝損傷和發(fā)展,從而引起肝細胞大量壞死。 吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)是一種抗氧化劑,能特異性抑制NF-κB活化。但抑制NF-κB的活化對暴發(fā)性肝衰竭病情進展的影響如何?研究甚少。本研究基于上述理論,檢測D-氨基半乳糖(D-galactosamine, D-GalN)和脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)導(dǎo)致的大鼠暴發(fā)性肝衰竭及應(yīng)用PDTC后肝組織NF-κB、TNF-α和iNOS的表達情況,分析NF-κB與肝細胞損傷程度、TNF-α、iNOS的關(guān)系,探討PDTC抑制NF-κB表達對大鼠暴發(fā)性肝衰竭炎癥損傷的影響及其分子機制,從分子生物學(xué)角度進一步證實NF-κB在暴發(fā)性肝衰竭炎癥損傷中的作用,為臨床如何調(diào)節(jié)NF-κB表達治療暴發(fā)性肝衰竭提供理論依據(jù)。 方法:1研究對象:雄性清潔級Wistar大鼠60只,體重180-200g。將大鼠隨機分為模型組30只,PDTC組30只。模型組腹腔注射D-GalN800mg/kg,之后立即皮內(nèi)注射LPS10μg/kg,制造暴發(fā)性肝衰竭模型。PDTC組制作FHF模型前1小時腹腔注射PDTC100mg/kg,其余同模型組。2標本的采集和保存:分別于注藥(D- GalN +LPS)后2,4,8,12,24小時行股靜脈放血處死,各時間點取模型組6只,PDTC組6只大鼠。留取血清,放血處死后立即剖腹取肝臟,取適量肝組織經(jīng)10%中性甲醛溶液固定,余經(jīng)液氮速凍后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?肝組織標本采用常規(guī)HE染色:光鏡下觀察肝臟病理學(xué)改變。4采用免疫組化S-P法,對肝組織標本進行NF-κB、TNF-α和iNOS的免疫組化染色。 5應(yīng)用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transarninase, ALT)和總膽紅素(total bilirubin, TB)水平。6采用酶聯(lián)免疫吸附試驗( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法檢測血清中TNF-α的表達情況。7應(yīng)用硝酸還原酶法檢測血清中NO的變化。8用半定量反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)( reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)方法研究NF-κB、TNF-α和iNOS mRNA在兩組肝組織中的表達情況。9統(tǒng)計學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料均以x±S表示,計數(shù)資料均采用等級表示,采用秩和檢驗等統(tǒng)計學(xué)方法進行分析,以α=0.05為檢驗水準。 結(jié)果: 1兩組動物一般狀況觀察:模型組隨著給藥時間的延長,大鼠一般狀況逐漸惡化,依次出現(xiàn)活動減少,飲水減少,毛發(fā)豎立,精神萎靡,嗜睡等。PDTC組各時間點大鼠與模型組相比情況有所好轉(zhuǎn),無嗜睡,昏迷等。 2兩組肝組織形態(tài)學(xué)觀察:⑴肝組織大體標本觀察:模型組肝臟組織隨時間延長出現(xiàn)充血、出血點、直至大塊淤斑及壞死,肝組織邊緣較鈍。PDTC組各時間點肝組織病變程度較模型組輕。肝組織邊緣較銳利,質(zhì)地柔軟,隨時間延長仍有彌漫性出血點,但無大塊淤斑及壞死。⑵肝組織HE染色:模型組隨著給藥時間延長,肝組織發(fā)生的病理改變逐漸加重,依次出現(xiàn)肝細胞水腫,炎細胞浸潤,嗜酸性變,凋亡小體,直至大片出血,肝細胞壞死融合,核溶解、碎裂,纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)塌陷。PDTC組大鼠肝臟病理改變與模型組同一時間點相比,炎癥壞死明顯減輕,仍可見多量凋亡小體。 3血清ALT,TB,TNF-α和NO水平變化:模型組大鼠用藥后2、4、8小時,ALT及TB水平緩慢升高,在12及24小時均急劇升高(P=0.000)。PDTC組與模型組相比均明顯降低,ALT兩組同時間點比較,除8小時外,其余各時間點均比模型組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。TB在4、12、24小時均比模型組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 模型組在用藥后2小時,血清TNF-α明顯升高,隨著時間的延長,逐漸下降(χ2=27.871, P=0.000)。PDTC組各時間點與模型組相比,TNF-α的升高幅度明顯降低,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 模型組在用藥后2小時起血清NO即出現(xiàn)明顯升高,12h升高最明顯,以后逐漸有所下降(χ2=24.062, P=0.000)。PDTC組2、8、12小時血清NO較模型組有明顯下降,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 4兩組肝組織NF-κB蛋白及mRNA表達變化NF-κB蛋白表達:模型組表達陽性細胞主要為肝細胞,隨給藥時間延長表達增加,12小時表達呈強陽性,隨著肝細胞壞死的加重24小時陽性細胞數(shù)表達減少。PDTC組8、12小時NF-κB蛋白表達與模型組同一時間點比較,明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 NF-κBmRNA表達:模型組NF-κBmRNA隨給藥時間延長表達增加,8小時達高峰,以后逐漸下降(χ2=26.307,P=0.000)。PDTC組4、8小時NF-κBmRNA表達與模型組同一時間點比較,明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 5兩組肝組織TNF-α蛋白及mRNA表達變化 TNF-α蛋白表達:模型組表達陽性細胞主要為肝細胞。隨給藥時間延長肝細胞胞漿陽性表達的細胞數(shù)逐漸增多, 12小時表達呈強陽性,24小時表達減少(χ2=19.361,P=0.000)。PDTC組4、8、12小時TNF-α蛋白表達與模型組同一時間點比較,明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 TNF-αmRNA表達:模型組TNF-αmRNA隨給藥時間延長表達增加,12小時升高最明顯,24小時有所下降(χ2=25.385, P=0.000)。PDTC組8、12、24小時TNF-αmRNA表達與模型組同一時間點比較,明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 6兩組肝組織iNOS蛋白及mRNA表達變化iNOS蛋白表達:模型組表達陽性細胞主要為肝細胞,隨給藥時間延長肝細胞胞漿陽性表達的細胞數(shù)逐漸增多,8小時呈強陽性表達,12小時及24小時陽性表達的細胞數(shù)有所下降,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=22.895,P=0.000)。PDTC組4、8小時iNOS蛋白表達與模型組同一時間點比較,明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 iNOSmRNA表達:模型組iNOSmRNA隨給藥時間延長表達增加,8小時升高最明顯,12小時及24小時逐漸下降,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=25.281,P=0.000)。PDTC組iNOSmRNA表達4小時及8小時與模型組同一時間點比較,明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 模型組及PDTC組iNOS mRNA的表達與NF-κB mRNA呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.978和0.940,P值分別為0.004和0.017。 結(jié)論: 1 TNF-α、iNOS、NO在D-GalN+LPS誘導(dǎo)的大鼠暴發(fā)性肝衰竭肝細胞的炎癥壞死中發(fā)揮了重要的作用。 2 NF-κB與iNOS、TNF-α密切相關(guān),證實了NF-κB在暴發(fā)性肝衰竭肝細胞炎癥壞死中起關(guān)鍵作用。 3 PDTC抑制了D-GalN+LPS導(dǎo)致的實驗性暴發(fā)性肝衰竭中NF-κB的活化。 4 PDTC能夠通過抑制NF-κB的表達明顯減輕D-GalN+LPS導(dǎo)致的大鼠暴發(fā)性肝衰竭肝細胞的炎癥壞死。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R575.3

【參考文獻】

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本文編號：2691526