【摘要】： 炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的病因和發(fā)病機制未明，嚴重危害健康，但缺乏特效治療方法，因此IBD的機制和治療的研究成為目前醫(yī)學研究的熱點。研究顯示腸道菌叢在IBD的發(fā)病中起關鍵作用，使用益生菌治療IBD有一定的療效，但其機制尚不清楚。2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)引起的結(jié)腸炎為乙醇造成結(jié)腸粘膜損傷后暴露的結(jié)腸蛋白與TNBS結(jié)合后形成自身抗原，導致免疫異常引起炎癥，其發(fā)病機制和臨床病理改變與人類IBD相似，其作為IBD的動物模型被國內(nèi)外廣泛用于IBD的實驗研究。本課題通過建立TNBS誘導的大鼠IBD模型，觀察和探討大鼠腸道部分菌群、內(nèi)毒素水平、結(jié)腸TLR2、TLR4和NF-κBp65的表達及腸系膜淋巴結(jié)樹突狀細胞表型和功能的變化及其意義，并分析和探討雙歧三聯(lián)活菌的作用。 第一部分實驗性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸菌群和血漿內(nèi)毒素水平的變化及雙歧三聯(lián)活菌的作用 目的 建立TNBS誘導的大鼠結(jié)腸炎模型，觀察和分析其結(jié)腸炎癥、菌群和血漿內(nèi)毒素水平的變化及雙歧三聯(lián)活菌的作用，并與美沙拉嗪的作用進行比較。 方法 雄性Wistar大鼠40只，隨機分為正常對照組(NC組)、陽性對照組(UC組)、雙歧三聯(lián)活菌治療組(Bifico，BC組)和美沙拉嗪對照組(MC組)，每組10只，采用TNBS(100mg／kg)乙醇溶液一次性灌腸法建立大鼠結(jié)腸炎模型；雙歧三聯(lián)活菌(2.2×10~9CFU／只)和美沙拉嗪(200mg／只)治療4周，鄰甲聯(lián)苯胺法檢測大便隱血情況。實驗結(jié)束時處死大鼠留取結(jié)腸及心臟采血分離血漿；HE染色觀察各組大鼠結(jié)腸炎癥情況，并盲法行炎癥評分，對結(jié)腸內(nèi)的部分細菌進行培養(yǎng)；鱟試驗測定大鼠血漿內(nèi)毒素水平，分析其變化，并觀察該益生菌對大鼠結(jié)腸炎癥、細菌和血漿內(nèi)毒素水平的影響。 結(jié)果 1．一般情況 TNBS灌腸后大鼠活動減少，懶動；食欲和食量下降、厭食，毛發(fā)無光澤，并出現(xiàn)腹瀉、粘液血便或隱血實驗陽性、體重下降等；經(jīng)Bifico和美沙拉嗪治療4周后，活動及體重增加，腹瀉及便血等癥狀好轉(zhuǎn)；于第2周時，UC組、BC組和MC組分別死亡2只、1只和1只大鼠，這4只大鼠明顯消瘦，腹部膨隆，解剖發(fā)現(xiàn)結(jié)腸局部增厚、水腫，與周圍組織粘連，近端結(jié)腸和小腸明顯擴張，腸壁變薄。NC組大鼠飲食和活動無明顯異常，體重較其他三組增加。 2．結(jié)腸粘膜損傷情況 肉眼觀察：UC組大鼠結(jié)腸與周圍組織粘連明顯，腸壁水腫、增厚，部分可見粘膜下出血；而BC組和MC組大鼠結(jié)腸與周圍組織粘連較輕，水腫及腸壁厚度輕于UC組；BC組較MC組重；NC組大鼠結(jié)腸肉眼觀察無明顯異常。光鏡下，UC組粘膜結(jié)構(gòu)損傷明顯，表現(xiàn)為廣泛粘膜糜爛，隱窩炎及膿腫，腺管排列紊亂，固有層充血水腫明顯，大量炎性細胞浸潤，部分標本見大片組織壞死：BC組和MC組有明顯的炎性細胞浸潤，部分見隱窩炎，但腺管排列整齊，無明顯膿腫及大片的組織壞死，BC組炎癥浸潤較MC組明顯；NC組大鼠結(jié)腸有輕至中度炎性細胞浸潤，但腺管排列整齊，無組織壞死及隱窩炎。 3．炎癥評分 四組炎癥評分分別為NC組：4.35±0.88，UC組：10.25±1.36，BC組：7.94±0.85和MC組：6.78±0.71。BC組和MC組大鼠結(jié)腸炎癥評分明顯低于UC組(P＜0.05和P＜0.01)，但高于NC組(P＜0.01)；BC組炎癥評分高于MC組(P＜0.05)。 4．細菌培養(yǎng)結(jié)果 (1)BC組結(jié)腸細菌中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量明顯高于UC組(P＜0.05)且接近NC組(P＞0.05)；腸桿菌和真菌數(shù)量明顯低于UC組(P＜0.05)，但腸桿菌數(shù)量高于NC組(P＜0.01)，真菌數(shù)量與NC組相比無明顯差異(P＞0.05)。(2)MC組腸桿菌數(shù)量明顯低于UC組(P＜0.05)，乳酸桿菌和雙歧桿菌計數(shù)雖然高于UC組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；其腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌較BC組低(P＜0.05)，真菌高于BC組(P＜0.05) MC組腸桿菌與NC組比較無明顯差異(P＞0.05)，真菌高于NC組(P＜0.01)，乳酸桿菌和雙歧桿菌低于NC組(P＜0.01)。(3)UC組大鼠結(jié)腸中腸桿菌和真菌數(shù)量明顯高于NC組(P＜0.01)，乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量明顯低于NC組(P＜0.01)。(4)四組大鼠糞便培養(yǎng)未見葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌。 5．內(nèi)毒素水平比較 BC組內(nèi)毒素水平明顯低于UC組(P＜0.05)，但高于NC組和MC組(P＜0.01和P＜0.05)；MC組內(nèi)毒素水平明顯低于UC組(P＜0.01)，但高于NC組(P＜0.01)；UC組內(nèi)毒素水平明顯高于NC組(P＜0.01)。 結(jié)論 TNBS誘導的結(jié)腸炎大鼠，其結(jié)腸粘膜炎癥明顯，存在結(jié)腸菌群紊亂，雙歧桿菌和乳酸桿菌顯著減少，同時伴血漿內(nèi)毒素水平明顯增高。雙歧三聯(lián)活菌可減輕大鼠的結(jié)腸炎癥，改善菌群紊亂，降低內(nèi)毒素水平，但其減輕炎癥的效果不如美沙拉嗪。 第二部分實驗性結(jié)腸炎大鼠腸系膜淋巴結(jié)中樹突狀細胞表型和功能的變化及雙歧三聯(lián)活菌的作用 目的 觀察和分析結(jié)腸炎大鼠腸系膜淋巴結(jié)中樹突狀細胞(Dendritic Cells，DCs)表型及刺激同種異體T淋巴細胞增殖能力的變化；并探討雙歧三聯(lián)活菌對結(jié)腸炎大鼠腸道DCs成熟與功能的影響。 方法 實驗動物、分組、模型的建立及給藥見第一部分(無MC組)，動物處死時取出全部腸系膜淋巴結(jié)。免疫組化染色法檢測腸系膜淋巴結(jié)DCs表面特征性標志0X-62和成熟標志CD83的表達；密度梯度離心法和淘洗法分離純化DCs；流式細胞儀分析DCs表面分子MHC-Ⅱ及共刺激分子CD86的表達；同種混合淋巴細胞反應(MLR)檢測DCs刺激同種異體T淋巴細胞增殖的能力。 結(jié)果 1．大鼠腸系膜淋巴結(jié)中0X-62及CD83的表達分別為：(1)0X-62：Nc組：198.6±87.7，UC組：1422.1±598.2，BC組：805.7±298.8。(2)CD83：NC組：87.6±24.4，UC組：709.2±199.6，BC組：461.7±172.3。BC組大鼠二者的表達明顯低于UC組(P＜0.05)，但高于NC組(P＜0.01)，UC組明顯高于NC組(P＜0.01)。 2．大鼠腸系膜淋巴結(jié)DCs上MHC-Ⅱ和CD86的表達率分別為：(1)MHC-Ⅱ：NC組：(26.23±7.19)％，UC組：(84.55±9.38)％，BC組：(66.49±8.40)％。(2)CD86：NC組：(20.46±7.69)％，UC組：(80.63±8.84)％，BC組：(59.79±10.03)％。BC組二者的表達明顯低于UC組，(P＜0.05)，但高于NC組(P＜0.01)，UC組明顯高于NC組(P＜0.01)。 3．MLR試驗顯示BC組大鼠DCs刺激同種異體大鼠T淋巴細胞增殖的能力明顯低于UC組，但強于NC組；UC組大鼠DCs刺激同種異體大鼠T淋巴細胞增殖的能力明顯強于NC組大鼠。 結(jié)論 結(jié)腸炎大鼠腸系膜淋巴結(jié)中成熟的DCs明顯增多，表面分子MHC-Ⅱ和共刺激分子CD86表達明顯上調(diào)，刺激T淋巴細胞增殖的能力增強，提示該結(jié)腸炎大鼠存在DCs活化增多，功能增強。雙歧三聯(lián)活菌可明顯減少其腸系膜淋巴結(jié)中成熟的DCs，使DCs表面的共刺激分子表達下調(diào)，提示該益生菌可減少腸道DCs成熟與活化，降低其刺激T淋巴細胞增殖的能力，間接減少腸系膜淋巴結(jié)T淋巴細胞的活化，從而減輕炎癥。 第三部分實驗性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸TLR2、TLR4和NF-κBp65的表達及雙歧三聯(lián)活菌的作用 目的 觀察和分析Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)、Toll樣受體4Toll-like receptor 4，TLR4)及核因子κBp65(Nuclear factor-kappap65，，NF-κBp65)蛋白及mRNA在結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸中的表達，并觀察雙歧三聯(lián)活菌干預后的變化，探討雙歧三聯(lián)活菌對該信號通路的影響。 方法 實驗動物、分組、模型的建立及給藥同第一部分(無MC組)，動物處死時留取全部結(jié)腸(包括盲腸)。免疫印記法(Western Blotting)和實時熒光定量PCR分別檢測大鼠結(jié)腸TLR2、TLR4、NF-κBp65蛋白及mRNA的表達。 結(jié)果 1．大鼠結(jié)腸TLR2、TLR4、NF-κBp65蛋白表達分別為：(1)NC組：TLR2：10.26±4.24，TLR4：8.16±4.50，NF-κBp65：3.16±1.52。(2)UC組：TLR2：47.20±4.62，TLR4：25.84±4.46，NF-κBp65：42.96±10.32。(3)BC組：TLR2：36.64±3.67，TLR4：19.71±3.28，NF-κBp65：30.74±7.71。分析顯示三者在BC組大鼠結(jié)腸的表達明顯低于UC組(P＜0.05)，但高于NC組(P＜0.01)，UC組明顯高于NC組(P＜0.01)。 2．TLR4、TLR2、NF-κBp65mRNA的表達(拷貝)結(jié)果為：(1)TLR2 mRNA在NC組、UC組和BC組的表達分別為(0.24±0.14)×10~3、(10.57±2.69)×10~3和(6.64±1.42)×10~3。BC組明顯低于UC組(P＜0.05)，高于NC組(P＜0.01)，UC組明顯高于NC組(P＜0.01)。(2)TLR4mRNA在NC組、UC組和BC組的表達分別為(0.21±0.11)×10~3，(8.58±2.71)×10~3和(5.29±1.54)×10~3；BC組的表達明顯低于UC組(P＜0.05)，高于NC組(P＜0.02)，UC組高于NC組(P＜0.02)。(3)NF-κBp65mRNA在NC組、UC組和BC組的表達分別為(0.17±0.07)×10~3、(9.69±2.71)×10~3和(6.21±1.33)×10~3。BC組的表達明顯低于UC組(P＜0.05)，但高于NC組(P＜0.01)，UC組的表達明顯高于NC組(P＜0.01)。 結(jié)論 TNBS誘導的結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸上模式識別受體TLR2、TLR4和轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65表達明顯增高，表明與抗原接觸機會增多和核轉(zhuǎn)錄增加；雙歧三聯(lián)活菌可明顯降低上述模式識別受體和NF-κBp65的表達，提示該益生菌可降低腸腔抗原的攝取，減少抗原的遞呈及核轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的生成。 第四部分實驗性結(jié)腸炎大鼠粘膜與系統(tǒng)水平細胞因子的變化及雙歧三聯(lián)活菌的作用 目的 觀察和分析結(jié)腸炎大鼠粘膜和系統(tǒng)水平細胞因子的情況及雙歧三聯(lián)活菌對細胞因子產(chǎn)生的影響。 方法 實驗動物、分組、模型的建立及給藥見第一部分(無MC組)。實驗結(jié)束時無菌取脾及小腸派伊爾氏淋巴濾泡(Peyers’patches，PP)，分離脾細胞和PP免疫細胞，與大腸桿菌標準株共同培養(yǎng)72h后，酶免疫分析法(EIA)檢測上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-10和TGF-β水平。 結(jié)果 1．大鼠脾細胞培養(yǎng)上清液細胞因子的變化 BC組TNF-α和IFN-γ水平明顯低于UC組(P＜0.05和P＜0.02)，但高于NC組(P＜0.01和P＜0.03)，其IL-10水平高于UC組(P＜0.05)，低于NC組(P＜0.02)。UC組TNF—α和IFN-γ水平明顯高于NC組(P＜0.01)，而IL-10明顯低于NC組(P＜0.01)。IL—12水平在三組大鼠間無明顯差異(P＞0.05)；各組TGF-β保持在相似的水平，雖有差異，但均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 2．大鼠PP細胞培養(yǎng)上清液細胞因子的變化 BC組TNF—α、IFN-γ和IL-12水平明顯低于UC組(P＜0.05)，高于NC組(P＜0.01)，其IL-10水平高于UC組(P＜0.05)但低于NC組(P＜0.02)。UC組TNF—α、IFN-γ和IL-12水平明顯高于NC組(P＜0.01)，IL-10明顯低于NC組(P＜0.01)。三組大鼠的TGF-β水平相似，各組間差異小，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 結(jié)論 TNBS誘導的結(jié)腸炎大鼠PP細胞和脾細胞對革蘭氏陰性大腸桿菌標準株的反應增強，促炎癥性細胞因子TNF—α、IFN-γ和IL-12產(chǎn)生增加，抗炎癥性細胞因子IL-10產(chǎn)生減少，粘膜水平和系統(tǒng)水平均存在促炎癥性細胞因子和抗炎癥性細胞因子間的平衡失調(diào)。雙歧三聯(lián)活菌可降低粘膜水平和系統(tǒng)水平的促炎癥性細胞因子的產(chǎn)生，增加抗炎癥性細胞因子的產(chǎn)生，減輕兩類細胞因子間的失平衡。
【圖文】：

較BC組低“入(0.05)，真菌高于BC組“代0.05)，UC組大鼠腸道細菌中腸桿菌和真菌數(shù)量明顯高于NC組“又0.01)，乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量明顯低于NC組(尸<0.01);四組中未培養(yǎng)出葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌，見表2和圖2表2各組大鼠糞便細菌檢測結(jié)果(lgCFU/g糞便，x士s)組別n腸桿菌乳酸桿菌雙岐桿菌真菌NC組 .103.98土0.416、89士 0.627.27士 0.842.15士0.51UC組 86.75士1.17a5，17士 0.85a5.14士 0.56a3.67士0.94aBe組 95

二.大鼠腸系膜淋巴結(jié)DcsOX一62和cD83的表達大鼠腸系膜淋巴結(jié)OX一62和CD83染色可見各組均有陽性染色。NC組、UC組和BC組OX一62染色的分析結(jié)果分別為198.6士87.7，1422.1士598.2，805.7士298.8，陽性面積比分別為(0.57士0.25)%，(4.1士1.7)%，(2.3士0.85)%;NC組、UC組和BC組CD83染色的分析結(jié)果分別為87.6士24.4，709.2士199.6，461.7士172.3;陽性面積t匕分別為(0.25士0.07)%，(2.0士0.57)%，(1.3士0.49)%。結(jié)果顯示，BC組大鼠腸系膜淋巴結(jié)中OX一62和CD83的表達明顯低于UC組(尸<0.05)，但高于NC組(尸<0.01);NC組大鼠腸系膜淋巴結(jié)中OX一62和CD83的表達較少，而UC組大鼠腸系膜淋巴結(jié)中OX一62和CD83的表達明顯增多(尸<0.01)見表1、圖1和彩圖2一5。表1大鼠腸系膜淋巴結(jié)DCsOX一62、CD83表達的比較〔(x士S)，m，]組別nOX一62陽性面積比%CD83陽性面積比%NC組10198.6士87.70.57士0.2587.6士24.40.25士0.07UC組81422.1士598.2a4.1士l.7a709.2士199.6a2.0士0.58aBC組9805.7士298.8ab2.3士0.85“b461.7士172.3“bl.3土0.49ab注:與NC組比較:“尸<0.01;與UC組比較:bP<0.05
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R574.62

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本文編號：2689438