【摘要】：很多肝臟疾病包括急慢性肝炎、重型肝炎、酒精性肝病等都不同程度的出現(xiàn)肝細(xì)胞的壞死和再生過程,通過減少肝臟的損傷,促進(jìn)肝臟的再生可以有效地緩解患者的病情。因此了解肝再生的調(diào)控機(jī)理對發(fā)現(xiàn)與肝損傷和再生過程相關(guān)疾病的治療和藥物開發(fā)具有重要意義。為更好的了解肝再生的調(diào)控機(jī)理,我們應(yīng)用了CCl4誘導(dǎo)小鼠肝再生動物模型,利用基因芯片檢測整個肝再生過程中的不同時間點肝臟內(nèi)的基因表達(dá)譜,并提出肝再生調(diào)控穩(wěn)態(tài)模型假說,從生物過程的通路和單個功能基因水平上對肝再生調(diào)控穩(wěn)態(tài)模型假說進(jìn)行驗證。本論文研究分為兩個部分:第一部分為CCl4誘導(dǎo)肝再生過程中基因表達(dá)譜的研究;第二部分為分泌性磷酸化蛋白-1(Secreted phosphoprotein 1,Spp1)對CCl4誘導(dǎo)肝再生過程調(diào)控作用的研究。 第一部分為了研究小鼠肝再生過程中的基因表達(dá)譜變化,我們給9周齡的雄性C57BL/6小鼠腹腔注射CCl4(花生油稀釋成25%濃度使用),劑量為1ml/kg體重,在注射CCl4后的0、0.5、1.5、4.5、7天時間點分別采樣,每次處死3只,將肝臟取出后抽取RNA用于基因芯片雜交,在每個小鼠肝臟的相同位置上,取一小塊用10%的福爾馬林溶液固定后用于制作石蠟切片和用增殖細(xì)胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen, PCNA)抗體進(jìn)行免疫組化分析。美國埃菲公司的Genechip? Mousegenome 430 2基因芯片的被用來檢測樣品中的基因表達(dá)譜,以0時間點為對照,對于其他4個時間點中,在至少一個時間點的表達(dá)變化大于或等于2倍的基因被篩選出來,用于聚類分析和生物學(xué)過程與功能分析,并對生物學(xué)過程分析結(jié)果中的氨基酸、尿素循環(huán)和氮元素代謝通路進(jìn)行了驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肝再生期間,共有2110個基因的表達(dá)水平發(fā)生了變化,這些基因根據(jù)其在肝再生期間的表達(dá)變化動態(tài)被分為14類,其中,先上升后下降和先下降后上升的基因分別占總數(shù)的11.51%和35.45%。在這些表達(dá)發(fā)生變化的基因中,調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因包括spp1在內(nèi)有217個,轉(zhuǎn)錄因子有117個,找出了符合穩(wěn)態(tài)模型的基因,建立了肝再生穩(wěn)態(tài)表達(dá)模型的基因表達(dá)譜,并揭示了肝再生過程中血液中氨基酸水平上升的分子機(jī)理。 第二部分小鼠spp1基因被克隆以及構(gòu)建了spp1原核與真核表達(dá)載體,并利用真核表達(dá)載體直接轉(zhuǎn)染小鼠骨骼肌來研究spp1基因在小鼠體內(nèi)過量表達(dá)對CCl4誘導(dǎo)肝再生模型小鼠肝再生的影響,也利用原核表達(dá)載體通過大腸桿菌BL21表達(dá)重組小鼠SPP1蛋白(recombinant mouse SPP1, rmSpp1),純化出純度達(dá)到98%的具有生物活性的rmSpp1。為了研究Spp1對肝再生模型小鼠的調(diào)控作用,通過給予CCl4誘導(dǎo)肝再生小鼠分別注射rmSpp1和抗小鼠Spp1抗體。8周齡的雄性小鼠被隨機(jī)分成4組,每組20只,具體處理如下:組1:實驗開始時,小鼠腹腔注射CCl4(花生油稀釋成25%濃度使用),劑量為1ml/kg體重,每只小鼠注射CCl4后立即皮下注射重組小鼠Spp1蛋白,劑量是1mg/kg,試驗開始后1、3、5、7天時間點分別采樣,每個時間點每組處死5只小鼠,收集血樣分離血清,檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine amino-transferase,ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)活性,抽取肝臟RNA,取相同位置的肝組織一小塊立即用10%的福爾馬林溶液固定,制作組織切片分析組織形態(tài)學(xué)變化,另外用PCNA免疫組化檢測肝細(xì)胞增殖情況;組2處理同組1,注射等體積的生理鹽水作為組1的對照;組3處理方法同組1,每只小鼠皮下注射20μl抗小鼠Spp1抗體的家兔血清;組4處理方法同組3,注射等體積的正常家兔血清作為組3的對照。結(jié)果顯示在3天時注射重組小鼠Spp1蛋白的模型小鼠體內(nèi)ALT活性顯著低于對照組(78.6±59.0 vs 186.6±109.0 IU/L,p=0.018),肝臟壞死區(qū)面積也顯著小于對照組(11.7±3.4% vs 21.0±4.4%,p=0.0006)。第3天時,小鼠的肝細(xì)胞增殖也顯著高于對照組(7.1±1.2 vs 3.8±1.0/ 0.01mm2, p=0.002)。相反,第3天,注射抗Spp1抗體小鼠體內(nèi)的ALT活性卻顯著高于對照組(426.9±166.5 vs 90.8±61.9, p=0.008),在3天和5天時肝臟的壞死面積比例也都顯著高于對照組(24.1±4.4% vs 8.6±1.4%,p=0.014與3.4±0.29% vs 1.7±0.45%,p=0.007)。但是第3天時注射抗Spp1抗體小鼠的肝細(xì)胞的PCNA陽性細(xì)胞數(shù)也顯著高于對照組(6.0±1.7 vs 3.3±0.7/ 0.01mm2,p=0.03)。 結(jié)論:通過基因芯片對肝再生期間肝臟內(nèi)基因的表達(dá)水平進(jìn)行動態(tài)分析,篩選出符合肝再生穩(wěn)態(tài)模型假說的基因,從而有效聚焦了調(diào)控肝再生的研究范圍,從氨基酸代謝相關(guān)通路基因表達(dá)水平的變化揭示了肝再生過程中氨基酸水平上升的機(jī)理。通過對符合肝再生調(diào)控穩(wěn)態(tài)模型的基因spp1進(jìn)行進(jìn)一步的功能研究。結(jié)果表明了spp1在肝臟損傷與再生過程中,可以有效保護(hù)肝細(xì)胞,減少細(xì)胞壞死和促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖,有效地促進(jìn)肝臟的再生。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R575

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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2 Salman Rahman;;Gene expression differences of regenerating rat liver in a short interval successive partial hepatectomy[J];World Journal of Gastroenterology;2004年18期

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本文編號：2688496