【摘要】：研究背景:非酒精性脂肪肝是最常見(jiàn)的慢性肝臟疾病之一,其發(fā)病及進(jìn)展過(guò)程極其復(fù)雜。肝臟的脂質(zhì)沉積(肝脂肪變)是大家公認(rèn)的非酒精性脂肪肝的早期階段;肝臟甘油三酯的從頭合成增加是非酒精性脂肪肝最重要的病理特征,也是導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積的關(guān)鍵原因。越來(lái)越多的研究認(rèn)為非酒精性脂肪肝可能是一種線粒體疾病,但線粒體功能在肝臟脂質(zhì)沉積中的具體作用仍不明確。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔生理性開放對(duì)維持線粒體功能和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用;其過(guò)度的、不可逆的開放將會(huì)導(dǎo)致線粒體應(yīng)激和功能紊亂,表現(xiàn)為呼吸鏈障礙、線粒體腫脹和活性氧蓄積。親環(huán)素D(CypD),一種位于線粒體基質(zhì)的肽輔氨酰異構(gòu)酶,是調(diào)控通透性轉(zhuǎn)換孔開放的始動(dòng)因子,但CypD表達(dá)的異常增加會(huì)導(dǎo)致通透性轉(zhuǎn)換孔過(guò)度開放和線粒體應(yīng)激。CypD缺失可以減輕刺激因素誘導(dǎo)的大腦皮層或骨骼肌的線粒體功能紊亂,改善阿爾茲海默病的學(xué)習(xí)、記憶障礙或胰島素抵抗。這為研究CypD在肝臟脂質(zhì)沉積中的作用提供理論基礎(chǔ)。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)是肝臟脂質(zhì)合成的關(guān)鍵酶。我們以往的研究顯示固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(SREBP-1c)在肝臟甘油三酯合成中發(fā)揮著不可或缺的作用。SREBP-1c前體通過(guò)高爾基體上的位點(diǎn)1蛋白酶(S1P)和位點(diǎn)2蛋白酶(S2P)催化裂解,成為有活性的SREBP-1c成熟體。SREBP-1c成熟體可以進(jìn)入細(xì)胞核,結(jié)合下游基因特定的SRE序列,調(diào)控甘油三酯合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。由于非酒精性脂肪肝可能是一種線粒體相關(guān)性疾病,線粒體應(yīng)激與SREBP-1c是否存在聯(lián)系尚需研究。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以上調(diào)SREBP-1c的表達(dá)并激活脂質(zhì)合成,CypD過(guò)度活化可以引起活性氧的蓄積、線粒體應(yīng)激加重,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+代謝紊亂。Ca2+代謝是聯(lián)系線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的橋梁,絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)同樣發(fā)揮著重要的連接作用。本課題研究發(fā)現(xiàn)CypD調(diào)控的線粒體應(yīng)激可以引發(fā)肝臟甘油三酯的合成增加。其機(jī)制可能是CypD的表達(dá)增加引起通透性轉(zhuǎn)換孔過(guò)度開放、線粒體應(yīng)激加重,Ca2+代謝紊亂,進(jìn)而通過(guò)p38MAPK影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,最終導(dǎo)致SREBP-1c的表達(dá)和活性增加。目的:1、明確在高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝中CypD及甘油三酯增加的關(guān)系。2、通過(guò)運(yùn)用CypD敲除的小鼠模型和尾靜脈注射CypD過(guò)表達(dá)腺病毒的小鼠模型,證實(shí)CypD對(duì)肝臟線粒體應(yīng)激和甘油三酯合成的作用。3、通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)CypD對(duì)肝臟SREBP-1c的上調(diào)作用。4、體內(nèi)通過(guò)肝臟特異性Ire1α敲除小鼠模型、體外通過(guò)小干擾RNA和抑制劑處理,證實(shí)CypD通過(guò)IRE 1α上調(diào)肝臟SREBP-1c的表達(dá)。5、體內(nèi)應(yīng)用CypD抑制劑驗(yàn)證其對(duì)肝臟甘油三酯沉積的預(yù)防和治療作用。研究方法:1、動(dòng)物模型建立:(1)高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠模型8周齡的雄性C57B1/6j小鼠分為兩組進(jìn)行實(shí)驗(yàn),高脂組小鼠進(jìn)食含60%kcal脂肪的高脂飲食,而對(duì)照組進(jìn)食普通飲食。(2)全身CypD和SREBP-1c基因敲除小鼠在SPF環(huán)境飼養(yǎng)并采用雜合子繁殖同窩對(duì)照的野生型及敲除小鼠,基因型鑒定后,雄性小鼠約8周齡進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(3)肝臟特異性Ire1α基因敲除小鼠Jre1α-LKO(肝臟特異性Ire1α基因敲除)小鼠是由lrelαflox/flox小鼠和Alb-Cre小鼠交配繁殖得到的�；蛐丸b定后,各基因型雄性小鼠約8周齡進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(4)CypD過(guò)表達(dá)小鼠模型小鼠AdPPIF(CypD過(guò)表達(dá))病毒和空載病毒AdEGFP用無(wú)菌PBS稀釋,以每只C57B1/6j小鼠2*108 pfu的量進(jìn)行尾靜脈注射,共注射三次,間隔六天。(5)環(huán)孢菌素A模型小鼠環(huán)孢菌素注射液即醫(yī)用山地明(簡(jiǎn)稱CsA)用無(wú)菌PBS稀釋,以每只C57B1/6j小鼠10 mg·kg-1·d-1或20 mg·kg-1d-1的量進(jìn)行腹腔注射;對(duì)照組注射相同體積的PBS。連續(xù)注射六周。(6)衣霉素模型小鼠先將衣霉素(Tm)用DMSO溶解成母液,濃度為10mg·ml-1,再用無(wú)菌PBS稀釋母液。Tm組的注射方案是:以每只C57Bl/6j小鼠1 mg·kg-1·d-1的量進(jìn)行腹腔注射;對(duì)照組注射相同體積的PBS。連續(xù)注射兩天。2、細(xì)胞培養(yǎng):HepG2細(xì)胞根據(jù)ATCC細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行培養(yǎng),小鼠肝原代細(xì)胞按照兩步膠原酶灌注法進(jìn)行提取。3、小動(dòng)物活體成像分析:通過(guò)小動(dòng)物活體成像技術(shù)在活體水平觀察特定刺激對(duì)CypD或SREBP-1c啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控作用。4、小鼠代謝籠分析:采用小鼠代謝籠分析方法檢測(cè)特定刺激對(duì)小鼠全身水平代謝的影響。5、線粒體腫脹分析:分離肝臟組織線粒體,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)特定刺激對(duì)鈣離子觸發(fā)的線粒體腫脹的影響。6、丙二醛含量分析:采用丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)特定刺激對(duì)肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化的影響。7、小鼠血糖、血脂及肝功檢測(cè)指標(biāo):血糖、血脂(甘油三酯、總膽固醇)及ALT、AST,采用Mindrary全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。8、采用試劑盒檢測(cè)肝臟中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量。9、電鏡分析:采用透射電鏡觀察小鼠肝臟線粒體形態(tài)及脂質(zhì)沉積。10、采用HE和油紅O染色檢測(cè)小鼠肝組織或細(xì)胞脂質(zhì)沉積。11、線粒體活性氧染色:運(yùn)用MitoSoxRed染料檢測(cè)小鼠肝組織或細(xì)胞的線粒體活性氧。12、采用Real time-PCR技術(shù)檢測(cè)SREBP-1c、Xbp-1等關(guān)鍵分子的基因表達(dá)。13、PCRarray分析:采用PCR芯片技術(shù)檢測(cè)小鼠肝組織中脂肪肝相關(guān)基因的表達(dá)。14、采用 Western Blot 技術(shù)檢測(cè) CypD、p38MAPK、IRE1 α、SREBP-1c 等關(guān)鍵分子的蛋白表達(dá)。15、采用小鼠體溫計(jì)檢測(cè)小鼠體溫。16、小鼠體脂分析:采用X-ray儀器分析小鼠體脂分?jǐn)?shù)。17、線粒體能量代謝實(shí)驗(yàn):采用seahorse線粒體能量分析儀器檢測(cè)特定刺激對(duì)細(xì)胞線粒體氧耗等的影響。18、采用免疫熒光雙染技術(shù)檢測(cè)CypD蛋白在線粒體的表達(dá),運(yùn)用Fura2-AM染料檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子。結(jié)果:1、肝臟脂質(zhì)沉積繼發(fā)于親環(huán)素D(CypD)的表達(dá)增加用普通飲食或60kcal%的高脂飲食喂養(yǎng)小鼠,在第2、4、8、12周末觀察肝臟脂質(zhì)沉積和線粒體應(yīng)激關(guān)鍵蛋白CypD的表達(dá)。動(dòng)物活體成像和western blot顯示,高脂喂養(yǎng)第4周末,肝臟CypD的熒光素酶活性及蛋白表達(dá)升高(p0.01),隨喂養(yǎng)周數(shù)延長(zhǎng)而增加。但直至第8周末,肝臟甘油三酯(TG)含量(p0.01)及脂質(zhì)沉積才有顯著增加;提示高脂喂養(yǎng)過(guò)程中,肝臟CypD的表達(dá)升高早于TG沉積,暗示了 CypD與肝臟脂質(zhì)沉積的潛在相關(guān)性,為CypD在脂肪肝發(fā)病中的作用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2、CypD與肝臟線粒體應(yīng)激和脂質(zhì)沉積呈正相關(guān)為研究CypD與肝臟TG沉積的關(guān)系,我們引入全身CypD基因敲除小鼠模型和肝臟CypD過(guò)表達(dá)模型,在基因敲除模型中采用普通飲食和高脂飲食喂養(yǎng)。(1)全身代謝的分析代謝籠數(shù)據(jù)顯示:普通飲食喂養(yǎng)下,CypD敲除鼠與野生型相比,氧耗和能量消耗無(wú)明顯變化;而高脂喂養(yǎng)時(shí),CypD敲除提高了小鼠的氧耗和能量消耗。另一方面,肝臟CypD過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠氧耗和能量消耗的影響不大,提示CypD并不直接影響全身代謝水平。(2)血清學(xué)指標(biāo)分析已有研究證實(shí)CypD敲除可緩解高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗,我們的血清學(xué)結(jié)果顯示,CypD敲除可降低高脂飲食下小鼠血清葡萄糖水平,而且血清TG水平也明顯降低(p0.05);普通飲食情況下,CypD敲除對(duì)小鼠血脂的影響不大。(3)肝臟線粒體應(yīng)激和脂質(zhì)沉積分析普通飲食喂養(yǎng)下,CypD敲除鼠與野生型相比,肝臟TG水平略有下降,而CypD敲除可明顯減輕高脂誘導(dǎo)的肝臟TG沉積(p0.01);CypD敲除對(duì)肝臟膽固醇水平無(wú)明顯影響。同時(shí)我們觀察CypD敲除對(duì)肝臟線粒體應(yīng)激的影響:高脂喂養(yǎng)的野生型小鼠與普通飲食組相比,線粒體腫脹明顯增強(qiáng)(0.05),CypD敲除消除了這種差異;CypD敲除也減少了線粒體活性氧的產(chǎn)生(p0.01)。另一方面,尾靜脈注射CypD過(guò)表達(dá)組與空載病毒組相比,肝臟TG含量(p0.05)增加、肝臟線粒體腫脹(p0.05)和活性氧積聚加重。說(shuō)明CypD敲除減輕了高脂誘導(dǎo)的肝臟線粒體應(yīng)激和TG沉積,而肝臟CypD過(guò)表達(dá)可加重肝臟線粒體應(yīng)激和TG沉積;提示肝臟TG沉積依賴于線粒體CypD的表達(dá)。3、CypD通過(guò)TG合成的關(guān)鍵酶SREBP-1c調(diào)控肝臟TG沉積通過(guò)PCR array篩選及qPCR驗(yàn)證,CypD敲除明顯抑制了高脂誘導(dǎo)的肝臟SREBP-1c的mRNA表達(dá)(p0.05)。高脂喂養(yǎng)可以明顯增加SREBP-1c前體(p-SREBP-1c)和成熟體(n-SREBP-1c)的蛋白表達(dá);而CypD敲除消除了高脂對(duì)SREBP-1c的作用,提示CypD可能調(diào)控SREBP-1c。肝臟CypD過(guò)表達(dá)小鼠模型中,肝臟SREBP-1c的熒光素酶活性和蛋白表達(dá)就空載病毒組明顯升高;而SREBP-1c敲除也消除了 CypD過(guò)表達(dá)對(duì)TG的增加作用(p0.01),說(shuō)明CypD通過(guò)SREBP-1c調(diào)控肝臟TG沉積。4、CypD通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵分子IRE1α調(diào)控肝臟SREBP-1c表達(dá)研究顯示CypD引起的活性氧積聚可激活p38 MAPK,而p38 MAPK又是聯(lián)系線粒體應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的橋梁。我們的研究顯示,CypD敲除可減少高脂誘導(dǎo)的肝臟p38MAPK、磷酸化IRE1α蛋白表達(dá),并緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。在肝臟特異性Ire1α基因敲除小鼠模型中,CypD無(wú)法上調(diào)肝臟SREBP-1c的熒光素酶活性、蛋白表達(dá)及脂質(zhì)沉積。說(shuō)明在CypD誘導(dǎo)SREBP-1c表達(dá)的過(guò)程中IRE1α發(fā)揮不可或缺的作用,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)層面初步探討CypD的作用機(jī)制。5、CypD 通過(guò) Ca2+/p38 MAPK/IRE1α 通路調(diào)控 SREBP-1c我們分別在小鼠肝原代和人HepG2細(xì)胞上發(fā)現(xiàn),CypD依次通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量、活性氧積聚,激活p38 MAPK/IRE1α通路,增加肝臟SREBP-1c的mRNA(p0.01)、蛋白表達(dá)及TG沉積(p0.01)。分別應(yīng)用p38 MAPK和IRE1α的抑制劑,以及肝臟特異性Ire1α基因敲除小鼠的原代細(xì)胞,在體外實(shí)驗(yàn)層面證實(shí) CypD 通過(guò) Ca2+/p38 MAPK/IRE1α 增加 SREBP-1c 的表達(dá),揭示了 CypD 發(fā)揮作用的分子通路。6、CypD抑制劑對(duì)非酒精性脂肪肝的預(yù)防和治療作用我們?cè)隗w內(nèi)應(yīng)用CypD抑制劑---環(huán)孢菌素A(CsA),尋求脂肪肝的預(yù)防和治療途徑。運(yùn)用高脂喂養(yǎng)的小鼠模型,分別在第4周和第30周末腹腔注射CsA,模擬肝臟脂質(zhì)沉積發(fā)生之前和嚴(yán)重脂質(zhì)沉積兩個(gè)階段。CsA減輕了兩個(gè)階段中高脂誘導(dǎo)的肝臟活性氧沉積,證明其發(fā)揮了抑制線粒體應(yīng)激的作用;同時(shí)檢測(cè)到CsA減少了肝臟SREBP-1c的熒光素酶活性、蛋白表達(dá)以及TG含量(p0.01)。為了消除CsA的繼發(fā)作用,我們?cè)隗w外應(yīng)用CypD的小干擾RNA,同樣證實(shí)CypD抑制劑可減少肝臟SREBP-1c表達(dá),為脂肪肝的防治提供了新的依據(jù)。結(jié)論:1、在高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝中,CypD的表達(dá)增加早于甘油三酯的沉積。2、CypD的表達(dá)增加可引發(fā)肝臟線粒體應(yīng)激和甘油三酯沉積。3、CypD上調(diào)肝臟甘油三酯沉積的機(jī)制是通過(guò)Ca2+/p38 MAPK/IRE1α/SREBP-1c通路實(shí)現(xiàn)的。4、CypD抑制劑CsA可預(yù)防和治療肝臟甘油三酯沉積,為NAFLD的防治提供新靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖１高脂喂養(yǎng)小鼠的肝臟ＣｙｐＤ表達(dá)早于脂質(zhì)沉積逡逑

圖２邋ＣｙｐＤ敲除對(duì)小鼠肝臟線粒體應(yīng)激和脂質(zhì)沉積的影響逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R575.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2688376