【摘要】： [研究背景及目的] 我國(guó)是HBV感染的高發(fā)地區(qū),1-59歲人群攜帶率約7.18%,由HBV感染導(dǎo)致的重型肝炎或肝功能衰竭仍然是我國(guó)臨床常見急危重疾病。我國(guó)學(xué)者將肝功能衰竭的臨床分型定為：急性肝衰竭(Acute Liver Failure or Fulminant Hepatits, FHF)、亞急性肝衰竭(Subacute Liver Failure, SALF)、慢加急性肝衰竭(Acute-on-Chronic Liver Failure, ACLF)和慢性肝衰竭(Chronic Liver Failure, CLF),其病情兇險(xiǎn),特別是急性肝衰竭死亡率高達(dá)70%-90%,臨床上缺乏特異、有效的治療手段和干預(yù)靶點(diǎn),除非緊急實(shí)施肝移植(國(guó)外以肝移植為主要治療手段,肝移植后5年存活率約為50%～60%),大部分患者預(yù)后不良,并發(fā)癥多。 病毒性重型肝炎的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,一般認(rèn)為是病毒和宿主的相互作用的結(jié)果,現(xiàn)今較為公認(rèn)的是“兩次損傷學(xué)說(shuō)”,即由病毒直接或間接(免疫反應(yīng))所致的原發(fā)性損傷和內(nèi)毒素—細(xì)胞因子軸—肝損傷學(xué)說(shuō)為核心的繼發(fā)性損傷,加之患者肝臟儲(chǔ)備功能較差更易導(dǎo)致乙型肝炎重癥化。在國(guó)外,重型肝炎多由藥物性因素引起,而在我國(guó)則多由HBV感染所致。由于HBV病毒是一種非溶細(xì)胞性嗜肝病毒,感染后造成肝損傷的主要機(jī)制是機(jī)體的免疫系統(tǒng)主動(dòng)清除被感染的肝細(xì)胞,因而對(duì)HBV感染后機(jī)體免疫功能的研究對(duì)于闡述乙型肝炎的發(fā)病和進(jìn)展等方面的機(jī)制具有針對(duì)性的作用。 在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中,我們利用人全基因組芯片技術(shù)(8600個(gè)探針),分析了重型乙型肝炎患者和輕中度慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)的基因差異表達(dá)譜,篩選出了在重型肝炎中高表達(dá)的263種基因,涉及多個(gè)類別。KCTD9 (Potassium Channel Tetramerisation Domain Containning 9)和KCNJ15 (Potassium Inwardly-rectifying Channel, Subfamily J, Member 15)是其中的兩種與離子通道相關(guān)的基因,在重型肝炎中這兩種基因表達(dá)分別上調(diào)6倍和7倍,通過(guò)后續(xù)的擴(kuò)大樣本的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該結(jié)果的可靠性。進(jìn)一步從基因和蛋白水平,我們檢測(cè)了265例臨床不同類型HBV感染患者包括輕中度和重型乙型肝炎患者、以及健康對(duì)照人群的肝組織和PBMC中KCTD9分子的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)其僅在重型乙型肝炎患者有顯著高表達(dá),提示其與病毒性乙型肝炎疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。為深入探討KCTD9分子在重型乙型肝炎發(fā)生發(fā)展中的作用及可能的機(jī)制,我們利用本實(shí)驗(yàn)室建立的MHV-3誘導(dǎo)的Balb/cJ小鼠暴發(fā)型肝炎模型開展了研究,發(fā)現(xiàn)KCTD9分子在MHV-3病毒感染后的小鼠肝組織和肝臟淋巴細(xì)胞尤其是NK細(xì)胞中高度表達(dá),與前期人類重型乙型肝炎的研究結(jié)果相似,提示可利用該模型深入剖析KCTD9參與HBV病毒誘導(dǎo)的重型肝炎肝細(xì)胞損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。 我們的前期工作首次表明,在病毒誘導(dǎo)的急性肝衰竭中肝臟NK細(xì)胞通過(guò)Fas/FasL和NKG2D/NKG2DL途徑增強(qiáng)對(duì)肝細(xì)胞的殺傷,本研究的主要目標(biāo)是進(jìn)一步闡明肝臟NK細(xì)胞在急性肝衰竭中的作用及作用機(jī)制,研究NK細(xì)胞高表達(dá)KCTD9分子在肝細(xì)胞損傷和重型肝炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程的作用及作用機(jī)制。具體研究?jī)?nèi)容如下： 一、NK細(xì)胞在重型病毒性肝炎中的作用及其免疫學(xué)機(jī)制研究 1、在HBV-ACLF患者肝組織中檢測(cè)NK細(xì)胞的分布,同時(shí)在外周血NK細(xì)胞中檢測(cè)FasL、NKP30和NKP46的表達(dá),探討NK細(xì)胞參與重型乙型肝炎急性肝損傷的機(jī)制； 2、在MHV-3誘導(dǎo)的Balb/cJ小鼠暴發(fā)型肝炎模型中,體內(nèi)耗竭NK細(xì)胞,觀察干預(yù)效果,探討NK細(xì)胞參與急性肝損傷的作用。 二、NK細(xì)胞新型分子KCTD9在重型乙型肝炎中的作用及其免疫學(xué)機(jī)制研究 1、以重型乙型肝炎患者為對(duì)象的研究 (1)收集重型乙型肝炎患者和輕中度慢性乙型肝炎患者外周血PBMC,對(duì)表達(dá)KCTD9的淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行定位。 (2)分析表達(dá)KCTD9分子的外周血NK細(xì)胞與重型乙型肝炎肝損傷嚴(yán)重程度的相關(guān)性。 2、利用人NK92細(xì)胞系進(jìn)行KCTD9分子的體外功能研究。 3、以MHV-3誘導(dǎo)的Balb/cJ小鼠暴發(fā)型肝炎模型為對(duì)象的研究。 (1)構(gòu)建針對(duì)小鼠KCTD9的shRNA干擾質(zhì)粒,非相關(guān)干擾質(zhì)粒以及小鼠KCTD9的全長(zhǎng)表達(dá)質(zhì)粒,觀察在小鼠暴發(fā)型肝炎模型中干擾或過(guò)表達(dá)KCTD9對(duì)于疾病病程的影響。 (2)在小鼠暴發(fā)型肝炎模型中觀察干擾或過(guò)表達(dá)KCTD9對(duì)于淋巴細(xì)胞功能的影響,研究KCTD9參與暴發(fā)型肝炎NK細(xì)胞介導(dǎo)的急性肝損傷的作用機(jī)制。 [研究方法] 1、利用免疫組織化學(xué)技術(shù),檢測(cè)HBV-ACLF患者和輕中度CHB患者肝組織中NK細(xì)胞的表達(dá)頻數(shù)；利用流式細(xì)胞術(shù)分析HBV-ACLF患者和輕中度CHB患者外周NK細(xì)胞FasL、NKP30和NKP46的表達(dá)情況。利用尾靜脈注射抗ASGM-1抗體耗竭NK細(xì)胞,觀察MHV-3誘導(dǎo)的Balb/cJ小鼠暴發(fā)型肝炎模型的生存率； 2、利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)KCTD9分子在重型乙型肝炎患者和輕中度慢性乙型肝炎患者PBMC中NK細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平,并收集病例資料,統(tǒng)計(jì)分析表達(dá)KCTD9的NK細(xì)胞比例與肝損傷嚴(yán)重程度的相關(guān)性。同時(shí)利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)重型乙型肝炎患者肝組織連續(xù)切片中NK細(xì)胞表達(dá)KCTD9的情況。 3、利用NK92細(xì)胞系,將人KCTD9表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染入該細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)觀察轉(zhuǎn)染24小時(shí)后NK92細(xì)胞KCTD9蛋白和活化分子CD69的表達(dá)；將轉(zhuǎn)染后的NK92細(xì)胞與HepG2.2.15細(xì)胞按照梯度效靶比共培養(yǎng),通過(guò)測(cè)定ALT釋放量,計(jì)算NK92細(xì)胞的殺傷效率；ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后NK92細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α的情況；利用流式細(xì)胞術(shù)篩選轉(zhuǎn)染后NK92細(xì)胞的活化性／抑制性受體表達(dá)譜。 4、構(gòu)建針對(duì)小鼠KCTD9的shRNA干擾質(zhì)粒和全長(zhǎng)表達(dá)質(zhì)粒,利用尾靜脈高壓注射技術(shù),將KCTD9干擾質(zhì)�；虮磉_(dá)質(zhì)粒注射入MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝炎模型小鼠體內(nèi),從小鼠的生存情況、血清轉(zhuǎn)氨酶水平、肝臟組織學(xué)改變等方面研究KCTD9分子在暴發(fā)型肝炎疾病病程中的作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)shRNA干擾對(duì)于本模型小鼠肝臟NK細(xì)胞活化和KCTD9表達(dá)的影響,利用磁珠分選技術(shù)將肝臟NK細(xì)胞分離純化,體外檢測(cè)其針對(duì)MHV-3感染的肝細(xì)胞的殺傷活性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)shRNA干擾后肝臟NK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(IFN-γ和TNF-α)水平。 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果] 1、NK細(xì)胞在病毒誘導(dǎo)的急性肝衰竭肝損傷中發(fā)揮重要作用。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,HBV-ACLF患者肝組織中NK細(xì)胞的表達(dá)顯著高于輕中度CHB患者；FasL在HBV-ACLF患者肝組織中的表達(dá)顯著高于輕中度CHB患者；表達(dá)NKP30、NKP46和FasL的外周NK細(xì)胞比例以及MFI水平均高于輕中度CHB患者。在MHV-3誘導(dǎo)的Balb/cJ小鼠暴發(fā)型肝炎模型中,耗竭NK細(xì)胞可以使該模型動(dòng)物生存率由0顯著上升到22.2%。 2、KCTD9在HBV-ACLF患者外周血淋巴細(xì)胞的表達(dá)增高,以NK細(xì)胞最為顯著。HBV-ACLF患者(15例)外周血中,表達(dá)KCTD9分子的NK細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的比例顯著高于輕中度CHB患者(21例),而CD8+T細(xì)胞的比例無(wú)顯著差義；HBV-ACLF患者外周NK、CD4~+T和CD8+T細(xì)胞表達(dá)KCTD9的平均熒光強(qiáng)度(MFI)水平均顯著高于輕中度CHB患者。將15例HBV-ACLF患者表達(dá)KCTD9的外周NK細(xì)胞比例與患者臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),其與ALT和AST水平高度正相關(guān),而與Tbil、Dbil、ALB、PTA、HBV DNA以及年齡無(wú)相關(guān)性,提示KCTD9可能參與了NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷及重型肝炎的發(fā)生。 3、KCTD9通過(guò)下調(diào)NKG2A表達(dá)在體外促進(jìn)NK92細(xì)胞活化。利用人KCTD9表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染NK92細(xì)胞系24小時(shí)后,NK92細(xì)胞表達(dá)KCTD9分子和活化標(biāo)志CD69分子水平均顯著增加；其在體外針對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的殺傷功能顯著增強(qiáng)：IFN-γ分泌增加；對(duì)系列NK細(xì)胞活化性／抑制性受體檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)NKG2A的表達(dá)顯著下調(diào)。 4、針對(duì)KCTD9的治療性shRNA干擾延緩MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝炎疾病進(jìn)展。成功構(gòu)建小鼠KCTD9表達(dá)質(zhì)粒、針對(duì)小鼠KCTD9的shRNA干擾質(zhì)粒和非相關(guān)對(duì)照干擾質(zhì)粒。利用構(gòu)建的干擾質(zhì)粒尾靜脈高壓注射MHV-3感染的Balb/cJ小鼠,可以使小鼠肝臟KCTD9的表達(dá)顯著下調(diào)；小鼠的生存率由0上升到22.2%：血清轉(zhuǎn)氨酶水平顯著下降；小鼠肝組織的病理情況得到改善。KCTD9表達(dá)質(zhì)粒注射組小鼠疾病病情加重。 5、針對(duì)KCTD9的治療性shRNA干擾降低肝臟NK細(xì)胞活化和殺傷功能。與非相關(guān)對(duì)照組相比,MHV-3感染后72小時(shí)shRNA干擾組肝臟NK細(xì)胞表達(dá)KCTD9和CD69分子均顯著下降；分離純化的肝臟NK細(xì)胞對(duì)感染后48小時(shí)肝細(xì)胞的殺傷效率顯著降低；肝臟NK細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α顯著下降。KCTD9表達(dá)質(zhì)粒注射組小鼠肝臟NK細(xì)胞活化和各項(xiàng)功能均顯著增強(qiáng)。 [結(jié)論] 1、本研究在人類HBV-ACLF疾病及小鼠暴發(fā)型肝炎模型中證實(shí)了NK細(xì)胞在肝臟組織中大量存在,活化的肝臟NK細(xì)胞可通過(guò)增強(qiáng)表達(dá)的FasL發(fā)揮殺傷功能,進(jìn)而在病毒誘導(dǎo)的急性肝損傷中發(fā)揮重要作用。 2、體外研究闡明了KCTD9分子通過(guò)降低NKG2A受體的表達(dá)促進(jìn)NK細(xì)胞活化,從而誘導(dǎo)之后的殺傷及細(xì)胞因子分泌功能。 3、本研究闡明了KCTD9通過(guò)活化NK細(xì)胞從而參與病毒誘導(dǎo)的急性肝細(xì)胞損傷及重型肝炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中。 4、小鼠暴發(fā)型肝炎模型中,干預(yù)KCTD9的表達(dá)可以通過(guò)降低肝臟NK細(xì)胞的活化而有效延緩病情進(jìn)展,提高生存率,為重型肝炎的診斷和治療提供了新的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)。
【圖文】：

表4利用Image一P，Plus6.0半定量分析切片中NK細(xì)胞表達(dá)。輕中度慢性肝炎患者重型肝炎患者l_0116.0104.02.63.06.026.02.015.05.02.0126.094.0120.0119.082.4100.069.672.0103.054.070.063.090.045.0101.092.07.073.0103.0

重型乙型肝炎和輕中度慢性乙型肝炎患者肝組織中FasL的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)重型肝炎患者肝臟中FasL大量表達(dá)，表達(dá)的部位多在壞死灶及其周圍浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞上，而慢性肝炎中也可見表達(dá)，但是表達(dá)量顯著少于重型肝炎患者肝組織(圖7)。悅;七妾云、’介獷、.矛，，，，’‘戶”棄戶“二·氣龍一熊，二價(jià)材沙一冬飛農(nóng)，_‘二:::J價(jià)忿稱.飛氣‘，丫圖7重型乙型肝炎和輕中度慢性乙型肝炎患者的肝組織中FasL的表達(dá):a和b分別為200x和400x實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照，c和d分別為200x和400義輕中度慢性肝炎患者肝組織，e和f分別為200義和400x重型肝炎患者肝組織。黑色箭頭標(biāo)注的棕色區(qū)域即為FasL的表達(dá)。5、重型乙型肝炎和輕中度慢性乙型肝炎患者外周血NK細(xì)胞FasL的表達(dá)。在前期研究中
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R512.6

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2688200