【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是我國最重大的傳染病之一，我國約有1.2億HBV攜帶者，其中2000多萬人為慢性乙肝患者。HBV感染及其相關疾病嚴重影響著患者的健康，同時也使患者家庭及社會承受著巨大的經濟負擔�，F在對HBV感染致病機理仍不是很清楚，對HBV感染的治療也未找到特別有效的藥物。目前臨床上廣泛使用的抗HBV感染藥物包括干擾素(interferon,IFN)和核苷（酸）類似物，但使用干擾素副作用較大，而核苷（酸）類似物存在停藥后容易復發(fā)，長期使用易發(fā)生耐藥變異。因此需要開辟新的思路以研發(fā)出新型高效的HBV感染相關疾病的治療藥物。 microRNA（miRNA）是一類非編碼單鏈小RNA分子，廣泛存在于動物、植物及病毒中，廣泛參與諸如細胞生長、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生以及病毒發(fā)病機制等多種過程的調節(jié)。最近的研究表明在病毒感染宿主的過程中，miRNA可能扮演了重要的作用。本研究旨在進行HBV感染相關miRNA分子的篩選并進行分子機制研究，希望上述研究結果能為從miRNA角度闡明HBV的感染機制提供理論依據，，同時也為HBV感染相關疾病的診斷和治療提供潛在的診斷標志物和藥物靶標。 本研究利用已建立的miRNA表達載體庫在細胞瞬時轉染模型中進行HBV復制相關miRNA分子的篩選并選擇其中具有代表性的miRNA分子進行抗HBV復制的分子機制研究。本論文的研究內容主要包括以下兩個方面：1）利用miRNA表達載體庫轉染HepG2細胞，進行HBV復制相關miRNA分子的篩選；2）miR-141抑制HBV復制的分子機制研究。本研究所獲得的研究結果如下： 1、采用miRNA表達載體與HBV表達載體瞬時轉染HepG2細胞作為篩選模型對miRNA表達載體庫進行了篩選，共獲得了6條與HBV復制相關的miRNA分子。對瞬時轉染后細胞培養(yǎng)液上清的HBsAg檢測表明miR-98，miR-137分子與HBV表達載體共轉染后細胞上清HBsAg水平升高； miR-101， miR-125a，miR-125b，miR-141分子與HBV表達載體共轉染后細胞上清HBsAg水平下降。 2、通過生物信息學方法對上述6個miRNA的宿主靶基因進行了預測，結果包含數個參與細胞轉錄調控及重要信號通路的基因，其中已有研究表明FOXA1，PPARA，RXRA等是HBV復制所必需的細胞調控因子。采用luciferase報告基因對上述miRNA與這些靶基因的相互作用進行了驗證。結果表明miR-101與HNF1B3’-UTR，miR-137與NF1及SP13’-UTR，miR-141與PPARA3’-UTR產生相互作用，抑制luciferase活性。 3、 miR-141抑制HBV復制的機制研究�；诩毎矔r轉染篩選結果及l(fā)uciferase報告基因靶位點的驗證結果，我們選擇miR-141分子作為抑制HBV復制的研究對象。通過細胞瞬時轉染驗證了合成miR-141分子（miR-141mimics）對HBV抗原（HBs/HBe）及病毒DNA都具有抑制作用，miR-141抑制劑（miR-141inhibitor）則對HBV抗原（HBs/HBe）表達具有促進作用，證明了篩選結果的正確；采用miRNA分子靶基因預測軟件（TargetScan）對PPARA基因序列中miR-141可能的靶位點進行了預測，結果顯示PPARA3’-UTR含有4個miR-141可能的靶標。采用luciferase報告基因對預測靶標位點的正確性進行了驗證，結果顯示miR-141可以與PPARA3’-UTR中3個靶位點產生作用；通過PPARA特異性siRNA驗證了抑制PPARA表達后對HBV抗原（HBs/HBe）及病毒DNA復制具有抑制，證明了miR-141作用于HBV復制的可能性；采用luciferase報告基因進行的啟動子功能分析表明，miR-141對PPARA的抑制作用可以降低HBV基因組啟動子活性，闡明了miR-141抑制HBV復制的分子途徑。 綜上所述，本研究采用瞬時轉染細胞模型對miRNA表達載體庫進行了篩選并驗證了miR-141對HBV復制具有抑制作用，發(fā)現HBV復制細胞因子PPARA是miR-141在此過程中的靶標。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R512.62

【引證文獻】

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1 鄭政隆;基于microRNAs調控的輕度慢性乙型病毒性肝炎脾胃濕熱證的生物學研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2013年

本文編號：2688199