【摘要】： 目的 將一株從健康人體十二指腸液標(biāo)本中分離出的雙歧桿菌CMS005行體外抗Hp的抑菌試驗及耐酸耐膽汁試驗，以考察其是否具備治療Hp感染的條件，并對其進行鑒定。 方法 將已有的雙歧桿菌CMS005菌株混懸液用平板打孔法(孔徑7mm)行體外抗Hp的抑菌試驗，根據(jù)抑菌圈直徑判斷體外抑制Hp作用，并行耐酸耐膽汁試驗，將此菌株接種在不同pH值的MRS液體培養(yǎng)基中和含牛膽汁的MRS液體培養(yǎng)基中，每隔30分鐘取樣進行活菌計數(shù)，作為衡量其生長狀況的指標(biāo)。并將此菌株進行藥敏試驗以及遺傳特性的鑒定等。 結(jié)果 1．CMS005菌株的細菌混懸液對Hp有明顯抑菌作用，其最小抑菌濃度為1×10~7CFU／ml。濃度為1×10~8CFU／ml的CMS005菌株抑菌效果與濃度為0.25mg／ml的氨芐青霉素相比較無顯著性差異(P＞0.05)。 2．CMS005菌株在pH值為2.5及以上的酸性環(huán)境下生長較好，在pH值為2.0及以下的酸性環(huán)境中生長受到抑制；在含牛膽汁的MRS液體培養(yǎng)基中生長良好，與在不含牛膽汁的MRS液體培養(yǎng)基中比較活菌計數(shù)無顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論 從健康人體十二指腸液中分離出的雙歧桿菌CMS005為益生菌株，其混懸液具有明顯的體外抗Hp效果。CMS005具有較好的胃酸和膽汁抗性。可將其進一步用于抗Hp的體內(nèi)試驗。 第二章胃內(nèi)不同微生態(tài)條件下建立H．pylori感染SPF級BALB／c小鼠胃炎模型的效果比較 目的 選取胃內(nèi)菌群相對較少的SPF級BalB／C小鼠，預(yù)先用抗生素灌胃以破壞其原籍菌群，從而導(dǎo)致小鼠胃內(nèi)微生態(tài)的失衡，再用Hp標(biāo)準(zhǔn)株感染小鼠，使得Hp得以在小鼠胃內(nèi)順利定植。和現(xiàn)有的Hp菌液直接灌胃造模法比較成模效果的差別。分析造模前后小鼠胃內(nèi)菌群的變化，探討菌群失衡在Hp感染小鼠過程中的作用，為Hp可能為條件致病菌的假設(shè)提供理論依據(jù)。并以此建立一種造模周期短且可靠的Hp感染的慢性胃炎模型。 方法 60只SPF級BALB／c小鼠隨機分為6組，第1組、第2組均用抗生素預(yù)處理后再予Hp菌懸液灌胃造模，為抗生素造模組，第3組、第4組予Hp菌懸液灌胃對照，為直接造模組，第5組、第6組為生理鹽水對照組。第1組、第3組和第5組于灌胃后4周處死；第2組、第4組和第6組于灌胃后8周處死。用快速尿素酶試驗、Giemsa染色和微需氧細菌培養(yǎng)檢測Hp定植，用涂片革蘭氏染色鏡檢和選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)法分析造模前后小鼠胃和十二指腸菌群的變化，用H-E染色檢查小鼠胃粘膜病理組織學(xué)改變。 結(jié)果 1．Hp感染結(jié)果：抗生素造模組中第1組、第2組小鼠胃內(nèi)Hp感染率均為100％，其中第2組小鼠的Hp定植量較第1組顯著增加(P＜0.05)。直接造模組中第3組小鼠胃內(nèi)Hp感染率為60％、第4組小鼠胃內(nèi)Hp感染率為50％。第3組小鼠的Hp定植量和第4組無明顯差異(P＞0.05)。生理鹽水對照組中第5組、第6組小鼠胃內(nèi)均未檢測到Hp定植。4周時抗生素造模組的Hp定植量較直接造模組明顯為高(P＜0.05)，8周時抗生素造模組的Hp感染率較直接造模組明顯為高(P＜0.05)�？股卦炷＝M和直接造模組的Hp感染率與生理鹽水對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。 2．菌群分析結(jié)果：抗生素造模組小鼠胃內(nèi)細菌總數(shù)量為10~4～10~5CFU／g組織，直接造模組小鼠胃內(nèi)細菌總數(shù)量為10~5～10~6CFU／g組織，生理鹽水對照組小鼠內(nèi)細菌總數(shù)量為10~5～10~6CFU／g組織�？股卦炷＝M的各種細菌數(shù)與生理鹽水對照組和直接造模組相比顯著下降(P＜0.05)，生理鹽水對照組和直接造模組各種細菌數(shù)二者比較無顯著性差異(P＞0.05)。 3．病理組織學(xué)結(jié)果：抗生素造模組第1組、第2組小鼠胃粘膜均有炎癥改變，且第2組小鼠較第1組小鼠炎癥程度明顯加重(P＜0.05)。直接造模組第3組、第4組小鼠粘膜均有炎癥改變，第3組和第4組小鼠的胃粘膜炎癥程度無明顯差異(P＞0.05)。抗生素造模組第1組小鼠較直接造模組第3、4組小鼠胃粘膜炎癥程度明顯加重(P＜0.05)，抗生素造模組第2組小鼠亦較直接造模組第3、4組小鼠胃粘膜炎癥程度明顯加重(P＜0.05)。抗生素造模組和直接造模組小鼠胃粘膜炎癥程度與生理鹽水對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論 本實驗用抗生素灌胃可破壞小鼠原籍菌群，使其胃和十二指腸菌群微生態(tài)失衡，從而促進Hp的定植。此種造模方法效果好于已有的Hp菌懸液直接灌胃造模法，提示Hp感染與胃內(nèi)菌群狀態(tài)有關(guān)，Hp可能為條件致病菌，胃內(nèi)微生態(tài)失衡有利于Hp的感染和定植。用此法可成功建立Hp標(biāo)準(zhǔn)株感染SPF級BALB／c小鼠的造模周期短而穩(wěn)定的慢性胃炎模型。 第三章雙歧桿菌CMS005與PPI合用治療H．pylori感染性胃炎的體內(nèi)有效性及對胃內(nèi)菌群的影響研究 目的 用本試驗第二部分中的抗生素預(yù)處理法建立Hp感染的SPF級BALB／c小鼠慢性胃炎模型，再用本試驗第一部分已鑒定的雙歧桿菌CMS005菌液灌胃治療，并和現(xiàn)有的根除Hp三聯(lián)療法相比較，觀察其對Hp感染的慢性胃炎治療的有效性。分析治療前后小鼠胃內(nèi)菌群的變化，探討糾正菌群失衡在治療Hp感染慢性胃炎中的作用，為Hp可能為條件致病菌的假設(shè)進一步提供理論依據(jù)。 方法 50只SPF級BALB／c小鼠隨機分為5組，第1組至第4組均用抗生素預(yù)處理后再Hp菌懸液灌胃造模，造模后4周開始治療，第1組為CMS005治療組，第2組為CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組，第3組為抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組，第4組為生理鹽水對照組，第5組為正常對照組，治療2周后處死小鼠。小鼠處死后用快速尿素酶試驗、Giemsa染色和微需氧細菌培養(yǎng)檢測Hp定植，作為治療是否有效的標(biāo)準(zhǔn)；用涂片革蘭氏染色鏡檢和選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)法分析治療前后小鼠胃和十二指腸菌群的變化，用H-E染色檢查小鼠胃粘膜病理組織學(xué)改變。 結(jié)果 1．根除Hp結(jié)果：CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組小鼠胃內(nèi)Hp感染率均為30％，根除率分別為60％和70％，抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組小鼠胃內(nèi)Hp感染率為20％，根除率為80％。生理鹽水對照組根除率為0。CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組均能有效根除Hp(P＜0.05)，且與抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組無顯著性差別(P＞0.05)。CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組、抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組三組小鼠胃內(nèi)Hp定植量均極少，互相之間無顯著性差異(P＞0.05)。 2．菌群分析結(jié)果：CMS005治療組小鼠胃內(nèi)細菌總數(shù)量為10~6～10~7CFU／g組織，CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組小鼠胃內(nèi)細菌總數(shù)量為10~6～10~7CFU／g組織，抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組與生理鹽水對照組小鼠胃內(nèi)細菌總數(shù)量為10~4～10~5CFU／g組織，正常對照組小鼠胃內(nèi)細菌總數(shù)量均為10~5～10~6CFU／g組織。抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組與生理鹽水對照組的各種細菌數(shù)與正常對照組相比顯著下降(P＜0.05)，而CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組的雙歧桿菌數(shù)與正常對照組相比顯著升高(P＜0.05)，CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組的雙歧桿菌數(shù)與單用CMS005治療組比較亦顯著升高(P＜0.05)。CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組的各種細菌數(shù)量均較正常對照組顯著升高(P＜0.05)。 3．病理組織學(xué)結(jié)果：CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組、抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組小鼠胃粘膜炎癥均較生理鹽水對照組明顯好轉(zhuǎn)(P＜0.05)，但與正常對照組有明顯差別(P＜0.05)。CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組、抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組三組小鼠胃粘膜炎癥無顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論 CMS005用于治療Hp感染的慢性胃炎有明顯效果，對Hp的根除率與傳統(tǒng)三聯(lián)療法比較無明顯差別，，且與質(zhì)子泵藥物合用效果更佳。對于Hp感染的胃粘膜炎癥治療效果明顯，與傳統(tǒng)三聯(lián)療法比較無明顯差別。CMS005能夠顯著提高胃內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量，而與質(zhì)子泵藥物合用則能提高多種正常細菌數(shù)量。 第四章TLR4在H．pylori致病機制中的作用和雙歧桿菌CMS005治療H．pylori感染性胃炎的機制探討 目的 比較Hp感染性胃炎的小鼠和用雙歧桿菌CMS005治療后的小鼠胃粘膜內(nèi)TLR4、IL-1β、TNF-a、IL-12在基因和蛋白水平上的表達含量變化，分析IL-1β、TNF-a、IL-12等炎癥因子和TLR4之間的相關(guān)性。探討TLR4在Hp致病機制中的作用和雙歧桿菌CMS005治療Hp感染性胃炎的機制。 方法 取試驗第三部分的各組小鼠胃粘膜標(biāo)本，用RT-PCR的方法半定量檢測TLR4、IL-1β、TNF-a、IL-12在基因水平上的表達，用Westernblotting法半定量檢測TLR4、IL-1β在蛋白水平上的表達，用免疫組織化學(xué)的方法檢測IL-1β和IL-12在蛋白水平上的表達。 結(jié)果 1．在基因和蛋白水平，CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組、抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組小鼠胃粘膜內(nèi)TLR4的表達均較生理鹽水對照組明顯降低(P＜0.05)。 2．在基因和蛋白水平，CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組、抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組小鼠胃粘膜組織中IL-1β的表達均較生理鹽水對照組明顯降低(P＜0.05)，但均較正常對照組明顯升高(P＜0.05)。 3．在基因和蛋白水平，CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組、抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組小鼠胃粘膜組織中IL-12的表達均較生理鹽水對照組明顯降低(P＜0.05)。 4．在基因水平，CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組、抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組小鼠胃粘膜組織中TNF-a的表達均較生理鹽水對照組明顯降低(P＜0.05)。 5．TLR4與IL-1β、TNF-a、IL-12均呈正相關(guān)。 結(jié)論 TLR4參與了Hp的致病機制，并且與IL-1β、TNF-a呈正相關(guān)，提示TLR4通路與下游的IL-1β、TNF-a、IL-12炎癥因子的激活相關(guān)。雙歧桿菌CMS005治療Hp感染性胃炎的機制之一是通過TLR4信號途徑起作用。
【圖文】：

氨節(jié)西林鈉、0.smg/ml的甲硝哇(P<0.05)。氨節(jié)西林鈉血藥濃度峰值一般不大于0.02mg/ml，可見CMs005菌液的抑菌效果已明顯強于氨節(jié)西林鈉血藥濃度的抑菌效果。結(jié)果見表1一1，圖1一4、1一5。表1一1為不同濃度的CMSO05與氨節(jié)西林鈉和甲硝哇對HP體外抑制作用的比較，其比較值為抑菌圈直徑，直徑為7~時即為孔徑大小而無抑菌圈產(chǎn)生，CMSO05菌液的濃度一、二、三、四分別為l.oxl09CFU加】、l.oxl08CFU加l、 l.oxl07CFU/lnl、1.oxl06CFU加l，氨節(jié)西林鈉的濃度一、二、三、四分別為25mg/ml、2.smg/inl、o.25mg/ml、o.o25mg/ml，甲硝哇的濃度一、二、三、四分別為smg/ml、0.smg/ml、o.osmg/ml、o.005mg/ml。

b:與 0.2smg/ml的氨千西林鈉、0.05mg/ml的甲峭哇抑菌圈大小有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)AB圖1一4以5005與氨千西林鈉對HP的體外抑制作用A圖為氨節(jié)西林鈉對HP的抑菌圈，其中1號孔為25mg/ml濃度，抑菌圈為45~;2號孔為2.smg/ml濃度，抑菌圈為26~;3號孔為0.25m創(chuàng)ml濃度，抑菌圈為14~;4號孔為0.025mg/ml濃度，無抑菌圈產(chǎn)生;B圖為CMs005對飾的抑菌圈，其中1號孔為 1.oxlogeFU厄d濃度，抑菌圈為17nun;2號孔為l.oxloserUllnl濃度
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R573

【引證文獻】

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1 張玲;楊彩梅;曹廣添;肖英平;曾新福;;Toll樣受體與益生菌免疫[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2013年01期

本文編號：2688108