【摘要】： 目的 將一株從健康人體十二指腸液標(biāo)本中分離出的雙歧桿菌CMS005行體外抗Hp的抑菌試驗(yàn)及耐酸耐膽汁試驗(yàn)，以考察其是否具備治療Hp感染的條件，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。 方法 將已有的雙歧桿菌CMS005菌株混懸液用平板打孔法(孔徑7mm)行體外抗Hp的抑菌試驗(yàn)，根據(jù)抑菌圈直徑判斷體外抑制Hp作用，并行耐酸耐膽汁試驗(yàn)，將此菌株接種在不同pH值的MRS液體培養(yǎng)基中和含牛膽汁的MRS液體培養(yǎng)基中，每隔30分鐘取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，作為衡量其生長(zhǎng)狀況的指標(biāo)。并將此菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)以及遺傳特性的鑒定等。 結(jié)果 1．CMS005菌株的細(xì)菌混懸液對(duì)Hp有明顯抑菌作用，其最小抑菌濃度為1×10~7CFU／ml。濃度為1×10~8CFU／ml的CMS005菌株抑菌效果與濃度為0.25mg／ml的氨芐青霉素相比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 2．CMS005菌株在pH值為2.5及以上的酸性環(huán)境下生長(zhǎng)較好，在pH值為2.0及以下的酸性環(huán)境中生長(zhǎng)受到抑制；在含牛膽汁的MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，與在不含牛膽汁的MRS液體培養(yǎng)基中比較活菌計(jì)數(shù)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論 從健康人體十二指腸液中分離出的雙歧桿菌CMS005為益生菌株，其混懸液具有明顯的體外抗Hp效果。CMS005具有較好的胃酸和膽汁抗性�？蓪⑵溥M(jìn)一步用于抗Hp的體內(nèi)試驗(yàn)。 第二章胃內(nèi)不同微生態(tài)條件下建立H．pylori感染SPF級(jí)BALB／c小鼠胃炎模型的效果比較 目的 選取胃內(nèi)菌群相對(duì)較少的SPF級(jí)BalB／C小鼠，預(yù)先用抗生素灌胃以破壞其原籍菌群，從而導(dǎo)致小鼠胃內(nèi)微生態(tài)的失衡，再用Hp標(biāo)準(zhǔn)株感染小鼠，使得Hp得以在小鼠胃內(nèi)順利定植。和現(xiàn)有的Hp菌液直接灌胃造模法比較成模效果的差別。分析造模前后小鼠胃內(nèi)菌群的變化，探討菌群失衡在Hp感染小鼠過(guò)程中的作用，為Hp可能為條件致病菌的假設(shè)提供理論依據(jù)。并以此建立一種造模周期短且可靠的Hp感染的慢性胃炎模型。 方法 60只SPF級(jí)BALB／c小鼠隨機(jī)分為6組，第1組、第2組均用抗生素預(yù)處理后再予Hp菌懸液灌胃造模，為抗生素造模組，第3組、第4組予Hp菌懸液灌胃對(duì)照，為直接造模組，第5組、第6組為生理鹽水對(duì)照組。第1組、第3組和第5組于灌胃后4周處死；第2組、第4組和第6組于灌胃后8周處死。用快速尿素酶試驗(yàn)、Giemsa染色和微需氧細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)Hp定植，用涂片革蘭氏染色鏡檢和選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)法分析造模前后小鼠胃和十二指腸菌群的變化，用H-E染色檢查小鼠胃粘膜病理組織學(xué)改變。 結(jié)果 1．Hp感染結(jié)果：抗生素造模組中第1組、第2組小鼠胃內(nèi)Hp感染率均為100％，其中第2組小鼠的Hp定植量較第1組顯著增加(P＜0.05)。直接造模組中第3組小鼠胃內(nèi)Hp感染率為60％、第4組小鼠胃內(nèi)Hp感染率為50％。第3組小鼠的Hp定植量和第4組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。生理鹽水對(duì)照組中第5組、第6組小鼠胃內(nèi)均未檢測(cè)到Hp定植。4周時(shí)抗生素造模組的Hp定植量較直接造模組明顯為高(P＜0.05)，8周時(shí)抗生素造模組的Hp感染率較直接造模組明顯為高(P＜0.05)�？股卦炷＝M和直接造模組的Hp感染率與生理鹽水對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。 2．菌群分析結(jié)果：抗生素造模組小鼠胃內(nèi)細(xì)菌總數(shù)量為10~4～10~5CFU／g組織，直接造模組小鼠胃內(nèi)細(xì)菌總數(shù)量為10~5～10~6CFU／g組織，生理鹽水對(duì)照組小鼠內(nèi)細(xì)菌總數(shù)量為10~5～10~6CFU／g組織。抗生素造模組的各種細(xì)菌數(shù)與生理鹽水對(duì)照組和直接造模組相比顯著下降(P＜0.05)，生理鹽水對(duì)照組和直接造模組各種細(xì)菌數(shù)二者比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 3．病理組織學(xué)結(jié)果：抗生素造模組第1組、第2組小鼠胃粘膜均有炎癥改變，且第2組小鼠較第1組小鼠炎癥程度明顯加重(P＜0.05)。直接造模組第3組、第4組小鼠粘膜均有炎癥改變，第3組和第4組小鼠的胃粘膜炎癥程度無(wú)明顯差異(P＞0.05)�？股卦炷＝M第1組小鼠較直接造模組第3、4組小鼠胃粘膜炎癥程度明顯加重(P＜0.05)，抗生素造模組第2組小鼠亦較直接造模組第3、4組小鼠胃粘膜炎癥程度明顯加重(P＜0.05)�？股卦炷＝M和直接造模組小鼠胃粘膜炎癥程度與生理鹽水對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)用抗生素灌胃可破壞小鼠原籍菌群，使其胃和十二指腸菌群微生態(tài)失衡，從而促進(jìn)Hp的定植。此種造模方法效果好于已有的Hp菌懸液直接灌胃造模法，提示Hp感染與胃內(nèi)菌群狀態(tài)有關(guān)，Hp可能為條件致病菌，胃內(nèi)微生態(tài)失衡有利于Hp的感染和定植。用此法可成功建立Hp標(biāo)準(zhǔn)株感染SPF級(jí)BALB／c小鼠的造模周期短而穩(wěn)定的慢性胃炎模型。 第三章雙歧桿菌CMS005與PPI合用治療H．pylori感染性胃炎的體內(nèi)有效性及對(duì)胃內(nèi)菌群的影響研究 目的 用本試驗(yàn)第二部分中的抗生素預(yù)處理法建立Hp感染的SPF級(jí)BALB／c小鼠慢性胃炎模型，再用本試驗(yàn)第一部分已鑒定的雙歧桿菌CMS005菌液灌胃治療，并和現(xiàn)有的根除Hp三聯(lián)療法相比較，觀察其對(duì)Hp感染的慢性胃炎治療的有效性。分析治療前后小鼠胃內(nèi)菌群的變化，探討糾正菌群失衡在治療Hp感染慢性胃炎中的作用，為Hp可能為條件致病菌的假設(shè)進(jìn)一步提供理論依據(jù)。 方法 50只SPF級(jí)BALB／c小鼠隨機(jī)分為5組，第1組至第4組均用抗生素預(yù)處理后再Hp菌懸液灌胃造模，造模后4周開(kāi)始治療，第1組為CMS005治療組，第2組為CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組，第3組為抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組，第4組為生理鹽水對(duì)照組，第5組為正常對(duì)照組，治療2周后處死小鼠。小鼠處死后用快速尿素酶試驗(yàn)、Giemsa染色和微需氧細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)Hp定植，作為治療是否有效的標(biāo)準(zhǔn)；用涂片革蘭氏染色鏡檢和選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)法分析治療前后小鼠胃和十二指腸菌群的變化，用H-E染色檢查小鼠胃粘膜病理組織學(xué)改變。 結(jié)果 1．根除Hp結(jié)果：CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組小鼠胃內(nèi)Hp感染率均為30％，根除率分別為60％和70％，抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組小鼠胃內(nèi)Hp感染率為20％，根除率為80％。生理鹽水對(duì)照組根除率為0。CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組均能有效根除Hp(P＜0.05)，且與抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組無(wú)顯著性差別(P＞0.05)。CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組、抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組三組小鼠胃內(nèi)Hp定植量均極少，互相之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 2．菌群分析結(jié)果：CMS005治療組小鼠胃內(nèi)細(xì)菌總數(shù)量為10~6～10~7CFU／g組織，CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組小鼠胃內(nèi)細(xì)菌總數(shù)量為10~6～10~7CFU／g組織，抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組與生理鹽水對(duì)照組小鼠胃內(nèi)細(xì)菌總數(shù)量為10~4～10~5CFU／g組織，正常對(duì)照組小鼠胃內(nèi)細(xì)菌總數(shù)量均為10~5～10~6CFU／g組織。抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組與生理鹽水對(duì)照組的各種細(xì)菌數(shù)與正常對(duì)照組相比顯著下降(P＜0.05)，而CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組的雙歧桿菌數(shù)與正常對(duì)照組相比顯著升高(P＜0.05)，CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組的雙歧桿菌數(shù)與單用CMS005治療組比較亦顯著升高(P＜0.05)。CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組的各種細(xì)菌數(shù)量均較正常對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)。 3．病理組織學(xué)結(jié)果：CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組、抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組小鼠胃粘膜炎癥均較生理鹽水對(duì)照組明顯好轉(zhuǎn)(P＜0.05)，但與正常對(duì)照組有明顯差別(P＜0.05)。CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組、抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組三組小鼠胃粘膜炎癥無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論 CMS005用于治療Hp感染的慢性胃炎有明顯效果，對(duì)Hp的根除率與傳統(tǒng)三聯(lián)療法比較無(wú)明顯差別，，且與質(zhì)子泵藥物合用效果更佳。對(duì)于Hp感染的胃粘膜炎癥治療效果明顯，與傳統(tǒng)三聯(lián)療法比較無(wú)明顯差別。CMS005能夠顯著提高胃內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量，而與質(zhì)子泵藥物合用則能提高多種正常細(xì)菌數(shù)量。 第四章TLR4在H．pylori致病機(jī)制中的作用和雙歧桿菌CMS005治療H．pylori感染性胃炎的機(jī)制探討 目的 比較Hp感染性胃炎的小鼠和用雙歧桿菌CMS005治療后的小鼠胃粘膜內(nèi)TLR4、IL-1β、TNF-a、IL-12在基因和蛋白水平上的表達(dá)含量變化，分析IL-1β、TNF-a、IL-12等炎癥因子和TLR4之間的相關(guān)性。探討TLR4在Hp致病機(jī)制中的作用和雙歧桿菌CMS005治療Hp感染性胃炎的機(jī)制。 方法 取試驗(yàn)第三部分的各組小鼠胃粘膜標(biāo)本，用RT-PCR的方法半定量檢測(cè)TLR4、IL-1β、TNF-a、IL-12在基因水平上的表達(dá)，用Westernblotting法半定量檢測(cè)TLR4、IL-1β在蛋白水平上的表達(dá)，用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)IL-1β和IL-12在蛋白水平上的表達(dá)。 結(jié)果 1．在基因和蛋白水平，CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組、抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組小鼠胃粘膜內(nèi)TLR4的表達(dá)均較生理鹽水對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)。 2．在基因和蛋白水平，CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組、抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組小鼠胃粘膜組織中IL-1β的表達(dá)均較生理鹽水對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)，但均較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)。 3．在基因和蛋白水平，CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組、抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組小鼠胃粘膜組織中IL-12的表達(dá)均較生理鹽水對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)。 4．在基因水平，CMS005治療組和CMS005＋質(zhì)子泵藥物治療組、抗生素＋質(zhì)子泵藥物治療組小鼠胃粘膜組織中TNF-a的表達(dá)均較生理鹽水對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)。 5．TLR4與IL-1β、TNF-a、IL-12均呈正相關(guān)。 結(jié)論 TLR4參與了Hp的致病機(jī)制，并且與IL-1β、TNF-a呈正相關(guān)，提示TLR4通路與下游的IL-1β、TNF-a、IL-12炎癥因子的激活相關(guān)。雙歧桿菌CMS005治療Hp感染性胃炎的機(jī)制之一是通過(guò)TLR4信號(hào)途徑起作用。
【圖文】：

氨節(jié)西林鈉、0.smg/ml的甲硝哇(P<0.05)。氨節(jié)西林鈉血藥濃度峰值一般不大于0.02mg/ml，可見(jiàn)CMs005菌液的抑菌效果已明顯強(qiáng)于氨節(jié)西林鈉血藥濃度的抑菌效果。結(jié)果見(jiàn)表1一1，圖1一4、1一5。表1一1為不同濃度的CMSO05與氨節(jié)西林鈉和甲硝哇對(duì)HP體外抑制作用的比較，其比較值為抑菌圈直徑，直徑為7~時(shí)即為孔徑大小而無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，CMSO05菌液的濃度一、二、三、四分別為l.oxl09CFU加】、l.oxl08CFU加l、 l.oxl07CFU/lnl、1.oxl06CFU加l，氨節(jié)西林鈉的濃度一、二、三、四分別為25mg/ml、2.smg/inl、o.25mg/ml、o.o25mg/ml，甲硝哇的濃度一、二、三、四分別為smg/ml、0.smg/ml、o.osmg/ml、o.005mg/ml。

b:與 0.2smg/ml的氨千西林鈉、0.05mg/ml的甲峭哇抑菌圈大小有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)AB圖1一4以5005與氨千西林鈉對(duì)HP的體外抑制作用A圖為氨節(jié)西林鈉對(duì)HP的抑菌圈，其中1號(hào)孔為25mg/ml濃度，抑菌圈為45~;2號(hào)孔為2.smg/ml濃度，抑菌圈為26~;3號(hào)孔為0.25m創(chuàng)ml濃度，抑菌圈為14~;4號(hào)孔為0.025mg/ml濃度，無(wú)抑菌圈產(chǎn)生;B圖為CMs005對(duì)飾的抑菌圈，其中1號(hào)孔為 1.oxlogeFU厄d濃度，抑菌圈為17nun;2號(hào)孔為l.oxloserUllnl濃度
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R573

【引證文獻(xiàn)】

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1 張玲;楊彩梅;曹廣添;肖英平;曾新福;;Toll樣受體與益生菌免疫[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2013年01期

本文編號(hào)：2688108