【摘要】： N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)是一種誘變劑,通過(guò)MNNG飲用水或直接灌胃可誘導(dǎo)出胃癌,但其具體致癌機(jī)制及對(duì)機(jī)體有無(wú)其它作用至今仍不清楚。近年來(lái)不管是基礎(chǔ)科研還是臨床實(shí)踐,人們都發(fā)現(xiàn)誘變劑并不象傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)的僅僅具有致癌作用,它們除了干擾細(xì)胞代謝、畸變?nèi)旧w外,還可以抑制細(xì)胞增生、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、提高免疫功能,因此,誘變劑對(duì)機(jī)體的作用是復(fù)雜的,除了長(zhǎng)期以來(lái)形成的單一致癌認(rèn)識(shí)外,也許還有不為我們所知的其它作用。端粒酶是一種核糖核蛋白,與細(xì)胞癌變密切相關(guān),有學(xué)者報(bào)道85%~90%的癌細(xì)胞端粒酶表達(dá)陽(yáng)性。在端粒酶3種結(jié)構(gòu)成分中,其逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)最為關(guān)鍵,是端粒酶表達(dá)的限速酶,二者呈正相關(guān),而在hTERT轉(zhuǎn)錄表達(dá)過(guò)程中,其基因啟動(dòng)子區(qū)是否發(fā)生甲基化又是一個(gè)重要的調(diào)控因素,對(duì)hTERT表達(dá)與否起重要作用。 鑒于以上認(rèn)識(shí),本課題采用原代培養(yǎng)人正常胃黏膜上皮細(xì)胞,觀察MNNG對(duì)其端粒酶活性和hTERT表達(dá)影響,并對(duì)干預(yù)后hTERT基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行甲基化分析,以了解MNNG干預(yù)后人正常胃黏膜上皮細(xì)胞端粒酶活性變化及引起這種變化的機(jī)制,以期為MNNG致胃癌機(jī)制的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為MNNG對(duì)機(jī)體的全面作用研究打下一定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下: 一、成人正常胃黏膜上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 磁性攪拌酶分離法培養(yǎng)成人正常胃黏膜上皮細(xì)胞。細(xì)胞活力在第4d達(dá)到最高點(diǎn),BrdU孵育有33.3%的細(xì)胞處于細(xì)胞周期S期和曾經(jīng)處于S期;接種密度高時(shí)細(xì)胞PAS反應(yīng)都呈陽(yáng)性,培養(yǎng)3天大部分細(xì)胞CK-18陽(yáng)性;透射電鏡可見(jiàn)細(xì)胞微絨毛、分泌顆粒、連接復(fù)合體等上皮細(xì)胞特征。 二、MNNG對(duì)人正常胃黏膜上皮細(xì)胞端粒酶活性和hTERT表達(dá)影響 采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(TRAP)檢測(cè)MNNG干預(yù)后人正常胃黏膜上皮細(xì)胞端粒酶活性,半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)hTERT表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)人正常胃黏膜上皮細(xì)胞同癌細(xì)胞一樣表達(dá)端粒酶,MNNG干預(yù)結(jié)果也與習(xí)慣認(rèn)識(shí)不同,不但不增強(qiáng)端粒酶活性,6.8uM和68uM兩個(gè)濃度組都使細(xì)胞端粒酶活性下降。MNNG干預(yù)后hTERT mRNA和hTERT蛋白表達(dá)變化與端粒酶變化一致。 三、MNNG干預(yù)后人正常胃黏膜上皮細(xì)胞hTERT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化分析 采用甲基化特異性PCR(MSP)和亞硫酸氫鈉修飾測(cè)序(BSP)兩種方法檢測(cè)hTERT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài),發(fā)現(xiàn)未干預(yù)人正常胃黏膜上皮細(xì)胞同癌細(xì)胞一樣hTERT基因啟動(dòng)子區(qū)CpG全部甲基化,MNNG干預(yù)后大部分CpG去甲基化。所檢測(cè)靶序列中含兩個(gè)髓樣特異性鋅指蛋白-2(MZF-2)結(jié)合基序,甲基化可以阻礙MZF-2轉(zhuǎn)錄因子與其DNA基序的結(jié)合。 以上結(jié)果提示:1、磁性攪拌酶消化法是一種簡(jiǎn)單可靠的胃黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法,所得細(xì)胞從數(shù)量和純度上能滿(mǎn)足一般實(shí)驗(yàn)要求。2、正常細(xì)胞多檢測(cè)不到端粒酶活性,但原代培養(yǎng)人正常胃黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)端粒酶且其活性與SGC-7901癌細(xì)胞株相似;hTERT表達(dá)亦如此。MNNG對(duì)二者的表達(dá)都有抑制作用。3、hTERT基因表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化成正相關(guān),MNNG對(duì)人正常胃黏膜上皮細(xì)胞hTERT啟動(dòng)子區(qū)具有去甲基化作用,其對(duì)端粒酶和hTERT的表達(dá)抑制可能通過(guò)這種去甲基化機(jī)制實(shí)現(xiàn)。4、甲基化可以通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合活性實(shí)現(xiàn)表達(dá)調(diào)控,MZF-2是一種負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子,MNNG干預(yù)后其結(jié)合基序附近CpG位點(diǎn)發(fā)生去甲基化,可能使MZF-2結(jié)合活性增強(qiáng),因此MZF-2可能參與了由去甲基化介導(dǎo)的端粒酶和hTERT表達(dá)抑制。
【圖文】：

圖 1-4 實(shí)驗(yàn)組 圖 1-5 替代對(duì)照?qǐng)D 1-4 培養(yǎng)第 2d BrdU 孵育 18h 胃黏膜上皮細(xì)胞 AEC 顯色，核紅染者為處于 S 期和曾經(jīng)處于 S 期細(xì)胞(×400)。圖 1-5 為替代對(duì)照(×400)。三、PAS 反應(yīng)培養(yǎng)第 2、5d 胃黏膜上皮細(xì)胞都呈以下結(jié)果：接種密度高時(shí)細(xì)胞都染成紫紅色，，高倍鏡下可見(jiàn)胞核旁黏原小滴(圖 1-6、1-7)。接種密度低時(shí)成團(tuán)的細(xì)胞 PAS 反應(yīng)都呈陽(yáng)性，而散在分布的幾乎不著色。經(jīng)唾液消化過(guò)的對(duì)照組細(xì)胞不著色(圖 1-8)

圖 1-4 實(shí)驗(yàn)組 圖 1-5 替代對(duì)照?qǐng)D 1-4 培養(yǎng)第 2d BrdU 孵育 18h 胃黏膜上皮細(xì)胞 AEC 顯色，核紅染者為處于 S 期和曾經(jīng)處于 S 期細(xì)胞(×400)。圖 1-5 為替代對(duì)照(×400)。三、PAS 反應(yīng)培養(yǎng)第 2、5d 胃黏膜上皮細(xì)胞都呈以下結(jié)果：接種密度高時(shí)細(xì)胞都染成紫紅色，高倍鏡下可見(jiàn)胞核旁黏原小滴(圖 1-6、1-7)。接種密度低時(shí)成團(tuán)的細(xì)胞 PAS 反應(yīng)都呈陽(yáng)性，而散在分布的幾乎不著色。經(jīng)唾液消化過(guò)的對(duì)照組細(xì)胞不著色(圖 1-8)
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R573

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