【摘要】：背景和目的膽汁淤積(cholestasis)是由于膽汁分泌及排泄障礙,包括膽汁酸合成的異常和膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)異常而導(dǎo)致的復(fù)雜臨床綜合癥,伴隨著病情的發(fā)生發(fā)展可能會(huì)出現(xiàn)肝纖維化、肝硬化,甚至肝功衰竭的現(xiàn)象。在過去的研究中人們對(duì)膽汁淤積發(fā)生的分子機(jī)制研究取得了很大進(jìn)展,但研究對(duì)象多集中于膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和膽汁酸合成關(guān)鍵蛋白,而對(duì)于在膽汁中含量占比最多的水以及轉(zhuǎn)運(yùn)水的通道蛋白在膽汁淤積中的功能及作用機(jī)制研究較少。水通道蛋白10(Aquaporin 10，AQP10)是水通道家族中的一員,和AQP3,AQP7，AQP8，AQP9同屬于水-甘油通道亞家族,這類水通道蛋白除轉(zhuǎn)運(yùn)水分子之外還轉(zhuǎn)運(yùn)甘油、尿素,在脂肪的代謝過程中也發(fā)揮重要作用。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)AQP10表達(dá)在十二指腸和空腸[1]、脂肪組織和皮膚[2],脂肪代謝異常和一些痕疹樣皮膚病的發(fā)生和AQP10表達(dá)異常有關(guān)。但AQP10在膽汁淤積中的作用暫無研究。本文我們旨在研究水通道蛋白10(Aquaporin10，AQP10)在膽汁淤積患者肝臟中的表達(dá)變化、產(chǎn)生此效應(yīng)的作用機(jī)制以及其相關(guān)的功能研究。方法1.我們通過蛋白免疫印跡(Western Blot，WB)、實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcription-PCR，RT-qPCR)、免疫熒光(Immunofluorescence,IF)確定AQP10在膽汁淤積患者肝細(xì)胞表達(dá)情況,并分析了患者的血清生化各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)與患者肝臟AQP10表達(dá)量之間的相關(guān)性。2.構(gòu)建體外膽汁淤積的細(xì)胞模型PLC/PRF/5-ASBT穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(Apical sodium-dependent bile acid transporter，ASBT),使用NF-κB抑制劑預(yù)處理細(xì)胞后再檢測(cè)細(xì)胞AQP10的mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。隨后,采用雙熒光素酶基因報(bào)告和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)研究發(fā)生此效應(yīng)的機(jī)制.3.構(gòu)建PLC/PRF/5-ASBTAQP10過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,使用結(jié)合型膽汁酸處理后,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽汁酸的含量。結(jié)果1.膽汁淤積患者肝臟細(xì)胞AQP10的表達(dá)量比對(duì)照組患者降低1倍。膽汁淤積患者血清及肝組織總膽汁酸含量與患者肝組織AQP10表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。2.結(jié)合型膽汁酸�；悄懰�(Taurocholicacid,TCA)可激活信號(hào)NF-κB通路。雙熒光素酶基因報(bào)告證明核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(Nuclear factor Kappa B，NF-κB)與AQP10啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)位于AQP10啟動(dòng)子的~434bp/-2285P。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,NF-κB直接負(fù)向調(diào)控AQP的表達(dá)。3.相同濃度結(jié)合型膽汁酸處理細(xì)胞后,與PLC/PRF/5-ASBT細(xì)胞相比,PLC/PRF/5-ASBTAQP10細(xì)胞內(nèi)總膽酸含量明顯降低。結(jié)論在膽汁淤積情況下,結(jié)合型膽汁酸TCA可激活NF-κB信號(hào)通路,NF-κB可直接結(jié)合到AQP10啟動(dòng)子-434bp至-228bp區(qū)域,下調(diào)肝臟AQP10表達(dá)。
【圖文】：

水分子轉(zhuǎn)運(yùn)的效率高達(dá)３０億個(gè)／秒，在尿液重吸收、脂肪吸收和腦脊逡逑液的形成流動(dòng)等過程發(fā)揮重要作用。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)的具有特異轉(zhuǎn)運(yùn)水功能的膜逡逑通道蛋白被統(tǒng)稱為ＡＱＰ。在結(jié)構(gòu)上，ＡＱＰ具有六個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖１．１），其逡逑中ＮＨ２－和ＣＯＯＨ－末端位于細(xì)胞質(zhì)中。水通道蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)是跨膜６次的單肽逡逑鏈（圖１．１．１邋Ａ＿Ｂ），氨基酸序列高度保守，含有天冬酰氨一脯氨酸一丙氨酸（Ａｓｎ－逡逑Ｐｒｏ－Ａｌａ，ＮＰＡ）重復(fù)序列它們是ＡＱＰ的特征序列［２１］。ＡＱＰ的高級(jí)結(jié)構(gòu)由同源四聚逡逑１逡逑

水分子轉(zhuǎn)運(yùn)的效率高達(dá)３０億個(gè)／秒，在尿液重吸收、脂肪吸收和腦脊逡逑液的形成流動(dòng)等過程發(fā)揮重要作用。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)的具有特異轉(zhuǎn)運(yùn)水功能的膜逡逑通道蛋白被統(tǒng)稱為ＡＱＰ。在結(jié)構(gòu)上，ＡＱＰ具有六個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖１．１），，其逡逑中ＮＨ２－和ＣＯＯＨ－末端位于細(xì)胞質(zhì)中。水通道蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)是跨膜６次的單肽逡逑鏈（圖１．１．１邋Ａ＿Ｂ），氨基酸序列高度保守，含有天冬酰氨一脯氨酸一丙氨酸（Ａｓｎ－逡逑Ｐｒｏ－Ａｌａ，ＮＰＡ）重復(fù)序列它們是ＡＱＰ的特征序列［２１］。ＡＱＰ的高級(jí)結(jié)構(gòu)由同源四聚逡逑１逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R575

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本文編號(hào)：2687213